Die Rolle der DNA-Protein-Crosslink Reparatur bei der meiotischen Rekombination, der T-DNA Integration und dem Gene Editing
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Obwohl DNA-Protein-Crosslinks (DPC) eine große Bedrohung für die Genomstabilität darstellen, wurden die wesentlichen Mechanismen der DPC Reparatur erst in den letzten Jahren bei Hefe und Säugern entdeckt und aufgeklärt. Bereits vor Projektstart konnten wir zeigen, dass ein Homolog der universellen Protease SPRTN/WSS1 (WSS1A) von entscheidender Bedeutung für die DPC Reparatur bei Arabidopsis ist. Im jetzt abgelaufenen Projekt ist es uns nun gelungen wesentliche Aspekte der DPC Reparatur in Pflanzen zu charakterisieren. Auf der eines Seite haben wir aufgeklärt wie Topoisomerase 2 DCP Intermediate (TOP2cc) in Pflanzen repariert werden. Da bei ihrer Reparatur Doppelstrangbrüche (DSBs) entstehen können, stellen sie eine große Gefahr für die Genomstabilität dar. Wir konnten zeigen, dass in Arabidopsis zwei Reparaturwege existieren: Einer ist durch die Tyrosyl-DNA-Phosphodiesterase 2 (AtTDP2) definiert, die in der Lage ist kovalente Bindungen zwischen TOP2 und der DNA zu hydrolysieren, der andere durch WSS1A. Als Zwischenschritt entstehen genomische DSBs, die mit den beiden bekannten Mechanismen der nicht homologen Endverknüpfung (NHEJ) repariert werden. Doppelmutanten-Analysen zeigte, dass „saubere“, durch AtTDP2 prozessierte DNA Enden hauptsächlich durch den klassischen NHEJ Weg ohne die Einführung von Mutationen ligiert werden. Im Gegensatz dazu ist der mutagene alternative NHEJ Weg vor allem für das Prozessieren von nicht-ligierbaren Enden zuständig. Weiterhin konnten wir Details zur Rolle von WSS1A für den Erhalt der Genomstabilität bei Pflanzen charakterisieren. WSS1A wird essentiell, wenn irgendein Faktor des RTR Komplexes der in das Auflösen von aberranten Replikationsintermediären involviert ist, fehlt. Auch die starke Reduktion der 45S rDNA Tandem Repeats in der Mutante weist auf einen Replikationsdefekt hin. Verlust von WSS1A führt zur Fragmentierung von Chromosomen in somatischen Zellen. Durch diesen somatischen Defekt können Zellen mit gebrochenen Chromomen in die Meiose übergehen, was zu einer Reduktion der Fertilität führt. Wenn das Ausschalten von WSS1A mit dem Verlust des klassischen oder im Besonderen des alternativen NHEJ Wegs kombiniert wird, zeigen die Doppelmutanten Wachstumsstörungen und eine deutliche Erhöhung der Chromosomenfragmentierungen. Diese Ergebnisse zeigen, dass WSS1A das Ausbilden von DSBs verhindert oder selbst in die DSB Reparatur involviert ist. Das letztere konnten wir ausschließen, da sich die Reparatur von mit CRISPR/Cas induzierten DSBs weder qualitativ noch quantitativ zwischen Mutante und Wildtyp unterschied. Unsere Untersuchung zeigen also, dass WSS1A durch das Entfernen von aberranten Replikationsintermediate mit kovalenten DNA-Protein Verknüpfungen die Ausbildung von schädlichen DSBs verhindert.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Repair of DNA-protein crosslinks in plants. DNA Repair, 87, 102787.
Hacker, Leonie; Dorn, Annika & Puchta, Holger
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The DNA‐dependent protease AtWSS1A suppresses persistent double strand break formation during replication. New Phytologist, 233(3), 1172-1187.
Hacker, Leonie; Capdeville, Niklas; Feller, Laura; Enderle‐Kukla, Janina; Dorn, Annika & Puchta, Holger
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The repair of topoisomerase 2 cleavage complexes in Arabidopsis. The Plant Cell, 34(1), 287-301.
Hacker, Leonie; Dorn, Annika; Enderle, Janina & Puchta, Holger
