Entschlüsselung der Kommunikation zwischen der Dhh1/DDX6 Helikase und dem Ccr4 Not Deadenylase-Komplex

• Antragstellerin: Dr. Eva Petra Absmeier
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 429892960

Ein zentraler Aspekt in der posttranskriptionellen Regulation der Genexpression ist der Abbau von Boten-Ribonukleinsäure (Boten-RNS). Zwei Hauptwege des Boten-RNS-Abbaus, einer in 5´-3´- und einer in 3´-5´- Richtung, existieren in der eukaryotischen Zelle. Als initialen Schritt haben beide die Verkürzung des am 3´-Ende liegenden Poly(A)-Schwanzes durch spezialisierte Enzyme (Deadenylasen) gemein. Die primäre Deadenylierungsmaschine in der Zelle ist der Multiproteinkomplex Ccr4-Not. Dieser beinhaltet zwei Deadenylasen, Caf1 und Ccr4, die aneinander binden und eine abgegrenzte Deadenylaseeinheit bilden. Die RNS-Helikase Dhh1/DDX6 ist ein bekannter RNS-Abbaufaktor und ein Bindungspartner von Ccr4-Not. Dhh1/DDX6 bindet in unmittelbarer Nähe der Deadenylaseeinheit, jedoch ist bisher noch nicht untersucht worden, ob Dhh1/DDX6 die Deadenylierung durch Ccr4-Not beeinflusst. Außerdem fehlen strukturelle Informationen über die Interaktion von Dhh1/DDX6 mit der Deadenylaseeinheit. Bemerkenswerterweise sind Boten-RNS Abbau und Translationselongation stark miteinander verwobene Vorgänge. Die molekularen Details der Kommunikation der Translationsmaschinerie mit dem 5´-3´-Boten-RNS-Abbauweg sind jedoch kaum bekannt. Interessant ist, dass Dhh1/DDX6 direkt Ribosomen bindet und sowohl Dhh1/DDX6 als auch Caf1 suboptimale Transkripte identifizieren können, wodurch diese direkt mit Dynamiken der Translation assoziiert sind. Im ersten Teil meines Antrags werde ich mich mit dem Effekt von Dhh1/DDX6 auf die Deadenylierung durch Ccr4-Not beschäftigen. Dazu werde ich initial das Interaktionsnetzwerk zwischen Dhh1/DDX6 und Ccr4-Not, insbesondere mit der Deadenylaseeinheit, mit rekombinant hergestellten Ccr4-Not Komponenten und Dhh1/DDX6 Varianten beschreiben. Basierend auf diesen Ergebnissen werde ich die Struktur von Dhh1/DDX6 im Komplex mit der Deadenylaseeinheit lösen. Zudem werde ich das funktionelle Zusammenspiel zwischen Dhh1/DDX6 und Ccr4-Not durch in vitro Deadenylierungsstudien mit rekombinant hergestellten Proteinen und in vivo Versuchen in Hefe adressieren. Im zweiten Teil meines Antrags werde ich die Kommunikation zwischen dem 5´-3´-Boten-RNS-Abbauweg und dem Ribosom durch direkte Kontakte mit Dhh1/DDX6 strukturell untersuchen. Strukturelle Untersuchungen in diesem Projekt kombinieren die Methoden der Kryo-Elektronenmikroskopie, makromolekularen Röntgenkristallographie und Massenspektrometrie. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden zum fundamentalen Verständnis posttranskriptioneller Regulation der Genexpression durch den Deadenylierungkomplex Ccr4-Not und der RNS-Helikase Dhh1/DDX6 beitragen. Des Weiteren wird diese Arbeit die molekularen Details der Kopplung zwischen Translation und dem 5´-3´-Boten-RNS-Abbauweg beleuchten.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: Großbritannien
• Gastgeberin: Dr. Lori Passmore