Neue Ansätze zur Untersuchung der PARylierung in lebenden Zellen

• Antragsteller: Professor Dr. Andreas Marx; Professor Dr. Andreas Zumbusch
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 430576836

Die Poly(ADP-ribos)ylierung (PARylierung) ist in den meisten Eukaryoten ein bedeutendes Posttranslational-Modifikations- und Signalereignis. Grundlegende Prozesse wie DNA-Reparatur und -Transkription werden von diesem transienten Polymer und dessen Bindung an Proteine koordiniert. ADP-Ribosyltransferasen (ARTs) bauen komplexe ADP-Ribose-Ketten auf verschiedene Akzeptorproteine durch Prozessierung von NAD+ auf. Die Komplexität der Modifikation und das Fehlen von geeigneten Werkzegen machen molekulare Studien zur PARylierung sehr herausfordernd. Aufbauend auf unserer erfolgreichen früheren Arbeit, die bereits zu mehreren gemeinsamen Veröffentlichungen führte, ist das Hauptziel dieses Verbundprojekts, Mittel für quantitative Untersuchungen der durch DNA-Lichtschädigung induzierten Protein-PARylierungsdynamik in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu etablieren. Unser Ansatz basiert auf der Entwicklung neuartiger, auf NAD+-basierender Werkzeuge und moderner optischer Mikroskopietechniken. Basierend auf den vorläufigen Ergebnissen wird die Marx-Gruppe Ansätze entwickeln, um modifizierte NAD+-Analoga durch die Zellmembran zu liefern, die die Zelllebensfähigkeit nicht beeinträchtigen. Es sind zwei Arten modifizierter NAD-Analoga vorgesehen, die die Abbildung (durch Modifikation mit einem fluoreszierenden Farbstoff) und die Affinitätsanreicherung von Protein ermöglichen, die durch die Verarbeitung von mit Desthiobiotin modifizierten NAD+-Analogen modifiziert werden. Die Zumbusch-Gruppe wird optische Experimente weiterentwickeln, um die NIR-Mikrostrahlung so zu optimieren, dass eine kontrollierte Induktion bestimmter DNA-Schadensarten möglich wird. Zu diesem Zweck werden Mittel geschaffen, um die Pulsenergie und die durchschnittliche Leistung des für die Mikrobestrahlung verwendeten NIR-Lasers unabhängig zu steuern. Gleichzeitig werden experimentelle Protokolle für die Anwendung von synthetischen NAD+-basierten Werkzeugen und die optische Mikroskopie der PAR-Bildung mit minimierten Auswirkungen auf die Zellgesundheit untersucht. Diese werden durch Live-Zellmikroskopie der PARylierungsdynamik ausgewählter Proteine nach DNA-Lichtschädigung untersucht und der Weg für zukünftige Anwendungen geebnet.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen