Neue Ansätze zur Untersuchung der PARylierung in lebenden Zellen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Poly(ADP-ribos)ylation (PARylierung) ist eine wichtige posttranslationale Modifikation und ein wichtiges Signal in den meisten Eukaryonten. Grundlegende Prozesse wie DNA Reparatur und Transkription werden durch Bindung dieses transienten Polymers an Proteine reguliert. ADP-ribosyltransferasen (ARTs) erzeugen auf verschiedenen Akzeptorproteinen komplexe ADP-riboseketten aus NAD+. Die Komplexität dieser Modifikationen und das Fehlen geeigneter Untersuchungswerkzeuge macht molekulare Studien von PARylation herausfordernd. Das Hauptziel dieses kollaborativen Projekts was die Bereitstellung von Hilfsmitteln für quantitative Untersuchungen von durch DNA Photoschaden induzierter Protein PARylierungsdynamik in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung. Der Ansatz basiert auf der Entwicklung neuartiger synthetischer NAD +-basierter Werkzeuge und neuer optischer Mikroskopiemethoden. Die Arbeitsgruppe Marx hat erfolgreich Methoden zur Einbringung modifizierter NAD+-Analoger durch die Zellmembran ohne Beeinträchtigung des Überlebens von Zellen entwickelt. Durch die Anwendung dieser Proben konnten erste Einblicke in das PARylom lebender Zellen gewonnen werden. Die Arbeitsgruppe Zumbusch hat zunächste den Einfluss der PAR Länge und seiner Verzweigung auf seine Wechselwirkung mit verschiedenen Proteinen untersucht. Anschließend wurde ein optisches Experiment zur Verfolgung der Wechselwirkung von Proteinen oder von Proteinen mit anderen Biomolekülen in lebenden Zellen aufgebaut. Dies beruhte auf der räumlichen aufgelösten Messung der Abnahme von Fluorescencelebesdauern eines markierten Proteins das seine Anregungsenergie auf ein zweites, markiertes Molekül in der Nähe überträgt (FLIM-FRET Mikroskopie). Mit diesem Experiment wurde zunächst der Glycosylierungsstatus von Proteinen in lebenden Zellen untersucht. Anschließend wurde ein gepulster Laser für die kontrollierte Induzierung von DNA Photoschaden in den FLIM Aufbau integriert. Mit diesem Experiment und den modifizierten NAD+ Molekülen aus der Marx Gruppe, war es schließlich möglich, in lebdenen Zellen die PARylierungskinetik von Proteinen zu untersuchen, die an der Reparatur von DNA Schaden beteiligt sind.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Profiling of the ADP‐Ribosylome in Living Cells. Angewandte Chemie International Edition, 61(18).
Lehner, Maike; Rieth, Sonja; Höllmüller, Eva; Spliesgar, Daniel; Mertes, Bastian; Stengel, Florian & Marx, Andreas
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Influence of chain length and branching on poly(ADP-ribose)–protein interactions. Nucleic Acids Research, 51(2), 536-552.
Löffler, Tobias; Krüger, Annika; Zirak, Peyman; Winterhalder, Martin J.; Müller, Anna-Lena; Fischbach, Arthur; Mangerich, Aswin & Zumbusch, Andreas
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A desthiobiotin labelled NAD+ analogue to uncover Poly(ADP‐ribose) polymerase 1 protein targets. ChemBioChem, 25(5).
Rieth, Sonja; Spliesgar, Daniel; Orth, Jan; Lehner, Maike; Kasprzyk, Renata; Stengel, Florian & Marx, Andreas
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Next‐Generation Metabolic Glycosylation Reporters Enable Detection of Protein O−GlcNAcylation in Living Cells without S‐Glyco Modification. Angewandte Chemie, 136(20).
Kufleitner, Markus; Haiber, Lisa Maria; Li, Shuang; Surendran, Harsha; Mayer, Thomas U.; Zumbusch, Andreas & Wittmann, Valentin
