Die Initiation der Replikation – Untersuchung des Mechanismus mit einem sequentiellen, Mikroskopie-basierten Ansatz

• Antragsteller: Dr. Markus Götz
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 431471305

Vor der eigentlichen Zellteilung muss jede Zelle eine exakte Kopie ihrer gesamten DNA erstellen, um die Stabilität des Genoms und die getreue Weitergabe der Erbinformation sicherzustellen. Unvollständige oder übermäßige DNA-Replikation könnten die Lebensfähigkeit der Tochterzellen stark beeinträchtigen. In Eukaryoten findet die DNA-Replikation in spezifischen Bereichen im Zellkern sowie zu einem bestimmten Zeitpunkt statt. Es besteht ein Zusammenhang zwischen dieser Regulation und der Anordnung des Chromatins. Der genaue Mechanismus ist allerdings bis jetzt nur im Ansatz verstanden.Die Replikation des eukaryotischen Genoms wird an tausenden von genomischen Segmenten parallel gestartet, sogenannten Replikationsursprüngen oder Origins. In einer einzelnen Zelle wird nur ein Teil dieser Origins verwendet, während, über eine Population von Zellen betrachtet, alle Ursprünge die Replikation initiieren können. Folglich existiert eine große Variabilität der verwendeten Origins von einer Zelle zur nächsten. Dies bedeutet auch, dass die Untersuchung des Mechanismus, der die Initiation der Replikation steuert, idealerweise unter Verwendung von Einzelzell-Methoden erfolgt. Interessanterweise entstehen trotz dieser Flexibilität Replikationsdomänen. Diese 0.5-1 Mb umfassenden DNA-Regionen werden zur selben Zeit dupliziert und beinhalten mehrere aktive Origins. Diese Gleichzeitigkeit legt einen Mechanismus nahe, der die Replikationsursprünge simultan aktiviert. Das vorherrschende Modell sagt voraus, dass die zugrundeliegende Chromatin-Struktur die Origins in räumliche Nähe bringt, was zu ihrer zeitgleichen Aktivierung führt. Aufgrund von technologischen Beschränkungen war es bisher aber nicht möglich diese Modell direkt zu testen.Im vorliegenden Antrag schlage ich die Verwendung eines Superresolution-Mikroskops (genauer 3D-STED) zusammen mit Hi‑M vor, einer vor kurzem im Gastlabor entwickelte Methode, die das sequenzspezifische, sequenzielle Markieren und Abbilden aller potentiellen Origins in einer Replikationsdomäne (etwa 20 Origins in einem 150-500 nm großen Cluster) erlaubt. Dieser einzigartige Ansatz wird es uns erlauben, die Position der Origins in Mauszellen mit Nanometer-Genauigkeit zu bestimmen und ihre Verteilung mit der großräumigen Chromatin-Konformation in der Replikationsdomäne zu vergleichen. Das vorgeschlagene Projekt ermöglicht eine direkte Beobachtung der räumlichen Organisation aller potentiellen Origins in einer Replikationsdomäne, während die Aktivierung der Origins stattfindet. Dies erlaubt ein besseres Verständnis der Auswirkungen der Chromatin-Konformation auf die Origin-Organisation und letztlich der Regulation der Genomreplikation, einem lebenswichtigen Prozess in jedem Organismus.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: Frankreich
• Gastgeber: Dr. Marcelo Nollmann