Aufklärung von Cargo-Rekrutierungsprozessen an ER Export Stellen

• Antragsteller: Dr. Christoph Kaether
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 431549950

Ein Drittel aller Proteine sind mit dem sekretorischen Weg assoziiert. An endoplasmatischen Retikulum (ER) Export Stellen (ERES) vermitteln COPII Hüllproteine mit Hilfsproteinen den ER-Export. Zusätzliche unbekannte Rekrutierungs-/Filtermechanismen, die durch den Sekretionsinhibitor FLI-06 blockiert werden, sind der COPII-Maschinerie vorgeschaltet. In einem Genom-weiten CRISPR/Cas Screen nach Genen, deren Verlust gegen FLI-06 resistent macht (loss-of-function) fanden wir die ER-Membranproteine YIPF5 und GOT1B. In einem komplementären Genom-weiten Aktivierungs-Screen (gain-of-function) identifizierten wir GOT1A, ein sehr ähnliches Homolog von GOT1B. In VSVG-EYFP Transportstudien sowie in Proliferationsassays konnten wir bestätigen, daß der Verlust von YIPF5 oder GOT1B und die Überexpression von GOT1A eine Resistenz gegen FLI-06 vermitteln. YIPF5 interagiert mit GOT1A/B und mit YIP1A und YOS1. Die molekulare Funktion dieser Proteine beim ER-Export ist nicht bekannt.Unsere Hypothese: YIPF5 und GOT1B sind Teil eines Rekrutierungs-/Filtermechanismus, welcher den Zugang zu ERES und damit ER-Export kontrolliert. GOT1A hat eine ähnliche Funktion wie GOT1B, ist aber insensitiv für FLI-06.Zum Testen der Hypothese tauschen wir einzelne Domänen zwischen GOT1A und B aus, um herauszufinden welches die funktionalen Domänen sind und worin die Unterschiede zwischen beiden bestehen. Mittels Ko-Immunopräzipitation von Austausch- und Deletionsmutanten wollen wir die Interaktionsdomänen zwischen YIPF5 und GOT1A/B bestimmen. In etablierten Transportassays (VSVG-EYFP und RUSH) soll untersucht werden, inwieweit YIPF5 und GOT1A/B mit Cargo und/oder mit COPII interagieren, in ERES konzentriert werden und das ER verlassen. Hierzu sollen Lebendmikroskopie, Immunpräzipitation und Deglykosylierungsassays durchgeführt werden. Um zu testen, ob FLI-06 direkt an YIPF5/GOT1B bindet, wollen wir einen Variomics-Screen zur Identifizierung FLI-06-resistenter Punktmutationen durchführen. Als Teil eines Filter-/Rekrutierungsmechanismus werden YIPF5 und GOT1A/B dynamisch mit anderen Proteinen interagieren. Zur Bestimmung des Interaktoms soll mit BirA-markiertem YIPF5 oder GOT1B eine BioID-Markierung benachbarter Proteine unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt werden: basal, im Hungerzustand (reduzierte Sekretion), mit FLI-06 Inhibition sowie nach aktivierter Sekretion. Anschließend werden biotinylierte Proteine massenspektroskopisch identifiziert und putative Interaktionspartner mit Ko-Immunpräzipitationen und knockdown-Experimenten validiert. Um zu testen, ob unsere Proteine Teil eines Filter-/Rekrutierungsmechanismus sind, soll der Export von fehlgefalteten, normalerweise im ER lokalisierter mutierter LDL-Rezeptoren und CFTR in Abwesenheit von YIPF5 und GOT1B untersucht werden. Zusammengefasst zielt unser Antrag darauf ab, unbekannte, COPII-vorgeschaltete Rekrutierungs-/Filtermechanismen zu charakterisieren und zu untersuchen, welche Rolle YIPF5 und GOT1A/B dabei spielen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen