Evolution des neurosekretorischen Systems der Insekten: Funktion der Prohormon-Konvertasen PC1/3 und PC2 im Käfer Tribolium castaneum
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Neuropeptide werden von Vertebraten wie dem Menschen und von Invertebraten wie Insekten gleichermaßen benutzt, um viele biologischer Prozesse zu regulieren. Die Prozessierung von Neuropeptiden benötigt verschiedene evolutionär konservierte Enzyme wie Prohormonkonvertasen (PC1/3 and PC2) und Carboxypeptidasen (CPE and CPD/Svr). Insekten können als Modell für das Verständnis molekularer Prozesse benutzt werden. Zudem sind die Insekten sehr divers und verschiedene Arten zeigen unterschiedliche Modi von hormongesteuerten Prozessen wie Entwicklung, Wachstum und Reproduktion. Drosophila melanogaster ist mit Bezug auf Neuropeptidprozessierung das wohl am besten verstandene Insektenmodell. Allerdings ist das neuropeptiderge System der Fliege eher untypisch da ansonsten hochkonservierte Gene die die Prozessierungsenzyme PC1/3 und CPE kodieren verloren gegangen sind. Darum haben wir die Funktion dieser Gene in Tribolium castaneum untersucht, einem Insektenmodel mit einem konservativerem Genkomplement. Zuerst haben wir geteilte und individuelle Funktionen der paralogen Genpaare PC1/3 und PC2 sowie CPE und CPD/svr analysiert. Interessanterweise haben die Gene, die in Fliegen verloren gegangen sind essentielle Funktionen im Käfer. RNAi gegen PC1/3 im Larvenstadium inhibiert das Wachstum und verhindert die Entwicklung zur Puppe. Eier von weiblichen Käfern, die mit CPE-RNAi behandelt wurden, sterben während der Embryogenese. Im Gegenteil dazu führt das Ausschalten von CPD/svr in Tribolium zu keinen starken Phänotypen. Es gibt also in diesem anderen Insekt keine funktionale Redundanz der Gene, die im Fliegen verloren gegangen sind. Wir haben weiterhin untersucht wie sich die Prohormonkonvertasen in Bezug auf Expression und Spezifität für bestimmte Neuropeptide unterscheiden. Um diese Fragen zu beantworten haben wir CRISPR-Cas9 benutzt, um genspezifische Reporterlinien herzustellen in denen ein Fluoreszenzprotein an das 3‘-Ende des Gens angeschlossen wurde. Das Peptid 2A verhindert hierbei, dass ein Fusionsprotein entsteht. Obwohl das Einfügen von langen Fragmenten durch Genomeditierung in Tribolium noch sehr ineffizient ist, haben wir es geschafft mit dieser Methode für beide Gene jeweils eine Reporterlinie herzustellen. Jetzt sind wir in der Lage die Genexpression im Nervensystem als auch in anderen Organen wie dem Darm zu visualisieren und Koexpression mit spezifischen Neuropeptiden festzustellen. Wir haben auch einen Screen durchgeführt, um Transkriptionsfaktoren zu identifizieren welche die Enzyme der Neuropeptidprozessierung als zentrales Merkmal von neuroendokrinen Zellen regulieren, oder allgemeiner, welche neuroendokrin gesteuerte Prozesse regulieren. Während wir mit unseren Methoden keine direkten Regulatoren Enzyme identifizieren konnten, haben wir pdm3 als Faktor charakterisiert, welcher die Produktion von Eiern in weiblichen Käfern limitiert. Pdm3 interagiert dafür mit dem Ecdysteroid- und dem Juvenilhormonmetabolismus. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass wir erfolgreich die essenziellen Funktionen der konservierten Enzyme zeigen konnten und zwei Reporterlinien herstellen konnten, die extrem wertvoll für die laufende Arbeit an der Spezifikation neuroendokriner Zellen und der Spezifität der Konvertasen sind. Zudem haben wir erstmalig gezeigt, dass pdm3 ein negativer Regulator der weiblichen Fertilität ist und unterschiedliche Hormonsysteme beeinflusst.
