Molekulare Mechanismen von Kationen- und Anionen-leitenden Channelrhodopsinen

• Antragsteller: Professor Dr. Klaus Gerwert
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 436212556

In der Optogenetik werden aktivierbare Zellen wie Neuronen durch Licht mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung angeregt. Hierbei werden meist mikrobielle Rhodopsine verwendet. Trotz ihrer enorm anwachsenden Bedeutung für optogenetische Anwendungen sind die molekularen Mechanismen noch weitestgehend ungeklärt. Hier wollen wir die molekularen Reaktionsmechanismen von Kationen- und Anionen-leitenden Channelrhodopsinen (CCRs und ACRs) durch zeitaufgelöste Step-Scan-FTIR-Spektroskopie, ergänzt durch UV/VIS- und Ramanspektroskopie zusammen mit Molekularbiologie und biomolekularen Simulationen aufdecken. Wir erwarten, dass der Vergleich von ACRs und CCRs die wichtigsten strukturellen Motive zeigen wird, die trotz ihrer sehr ähnlichen Strukturen ihre unterschiedlichen Funktionen bestimmen. Unsere kürzlich veröffentlichten Daten stellen ein Photozyklen-Modell für das optogenetische Werkzeug CrChR2 vor. Dieses Modell klärt die Widersprüche zwischen spektroskopischen und elektrophysiologischen Daten auf: CrChR2 durchläuft einen verzweigten Photozyklus, der sich in einen stark protonen- und ionenleitenden, kurzlebigen, dunkel-adaptierten (="anti-Zyklus") und einen schlecht protonenleitenden, aber langlebigen, licht-adaptierten Photozyklus (="syn-Zyklus") unterteilt. Kontinuierliche Beleuchtung führt zur Akkumulation des langsamer abklingenden syn-Zyklus, der die geringeren Fotoströme aufgrund der schlechteren Ionenleitfähigkeit erklärt.In unserem Antrag gehen wir auf die folgenden Schlüsselfragen ein:(1) Welche molekularen Mechanismen liegen der Öffnung des Kationenkanals CrChR2 im anti-Zyklus zugrunde?(2) Welche molekularen Mechanismen liegen der Öffnung des Anionenkanals GtACR1 zugrunde?(3) Warum zeigen ACRs wesentlich höhere Ionenleitfähigkeiten als CCRs?(4) Welche Aminosäuren induzieren die funktionellen Unterschiede von ACRs und CCRs, insbesondere im Vergleich von CrChR2 und GtACR1?Um mechanistische Erkenntnisse mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung zu erhalten, setzen wir spektroskopische Messungen ein. Anschließend werden biomolekulare Simulationen verwendet, um die strukturellen Details zu entschlüsseln, die in den spektroskopischen Daten kodiert sind. Die Funktionalität der Kanäle wird durch elektrophysiologische Messungen unserer Kooperationspartner überprüft. Hierbei werden Gemeinsamkeiten und Unterschiede in den Struktur/Funktions-Beziehungen von ACRs und CCRs aufgeklärt, die für ihre unterschiedliche Leistungsfähigkeit, insbesondere in Bezug auf die Ionenleitfähigkeit, verantwortlich sind. Mit diesem Wissen wollen wir durch ortsspezifische Mutagenese die Funktionalitäten von ACRs auf CCRs und umgekehrt übertragen. Hierbei wollen wir die Bildung des syn-Zyklus von CrChR2 unterdrücken, wodurch der Inaktivierungseffekt reduziert wird und eine CrChR2-Variante mit erhöhter Ionenleitfähigkeit geschaffen werden sollte. Diese Variante besitzt das Potenzial, optogenetische Anwendungen deutlich zu verbessern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen