Molekulare Mechanismen von Kationen- und Anionen-leitenden Channelrhodopsinen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In der Optogenetik werden aktivierbare Zellen wie Neuronen durch Licht mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung angeregt. Dazu werden meist mikrobielle Rhodopsine verwendet, deren molekularen Mechanismen jedoch noch weitestgehend ungeklärt sind. Im Rahmen der Förderung haben wir einen Beitrag zur Aufklärung der molekularen Reaktionsmechanismen von Kationen- und Anionen-leitenden Channelrhodopsinen (CCRs und ACRs) geleistet. Hierzu haben wir zeitaufgelöste Step-Scan-FTIR-Spektroskopie, ergänzt durch UV/VIS- und Ramanspektroskopie zusammen mit biomolekularen Simulationen verwendet. Durch die spektroskopischen Methoden erhielten wir mechanistische Erkenntnisse mit hoher räumlichzeitlicher Auflösung, deren strukturelle Details anschließend mit biomolekularen Simulationen entschlüsselt wurden. Die gewonnen Erkenntnisse sind mit existierenden elektrophysiologischen Daten in Zusammenhang gesetzt worden. Ein Schlüsselprotein der Optogentik ist das CCR CrChR2, welches jedoch nur sehr geringe Photoströme erzeugt, wenn es den gering leitenden syn-Zyklus seines verzweigten Photozyklus durchläuft. Während des Förderzeitraums konnte mittels zeitaufgelöster Step- Scan-FTIR-Spektroskopie nachgewiesen werden, dass das homologe ACR GtACR1 nur den hochleitenden anti-Zyklus aufweist. Die Korrelation zwischen Spektroskopie und Elektrophysiologie gab Aufschluss über molekulare Gating-Mechanismen und ihre Rolle bei den charakteristischen hohen Photoströmen. Die mechanistische Bedeutung der Aminosäure E68 im Central Gate wurde in diesem Zusammenhang gezeigt. Zusätzlich entdeckten wir, dass bereits aus dem O-Intermediat von GtACR1 ein Photozyklus induziert werden kann. In weiteren FTIR-spektroskopischen Untersuchungen wurden Konformations- und Umgebungsveränderungen der protonierten Schiff-Base festgestellt, auf deren Grundlage wir einen „vorgeöffneten“ Zustand von GtACR1 postulieren, der eine schnelle Kanalöffnung ermöglicht und die hohe Effizienz des Kanals erklärt. Darüber hinaus haben wir einen optimierten Rechenansatz zur Berechnung der Isomerisierung des Retinals und der damit verbundenen Konformationsänderungen entwickelt. Wir haben diese Strategie angewandt, um die Isomerisierung des Retinals in CrChR2 zu untersuchen und beobachteten die spontane Bildung einer Mischung aus zwei Isomerisierungszuständen, sowie die Neubildung des nicht-isomerisierten Zustands. Diese Ergebnisse stimmen mit dem beobachteten gespaltenen Photozyklus von CrChR2 überein. Zusätzlich konnten Strukturmodelle für frühe Intermediate beider Zyklen vorhergesagt werden. Die gewonnenen Erkenntnisse aus spektroskopischen Messungen und biomolekularen Simulationen tragen dazu bei den molekularen Mechanismen innerhalb der Retinalproteine mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung besser zu verstehen und vorherzusagen. Auf dieser Basis können bessere optogenetische Tools entwickelt werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Time-resolved spectroscopic and electrophysiological data reveal insights in the gating mechanism of anion channelrhodopsin. Communications Biology, 4(1).
Dreier, Max-Aylmer; Althoff, Philipp; Norahan, Mohamad Javad; Tennigkeit, Stefan Alexander; El-Mashtoly, Samir F.; Lübben, Mathias; Kötting, Carsten; Rudack, Till & Gerwert, Klaus
