Neue bio-synthetische Hybridkonstrukte zur Aufklärung und Beeinflussung der Wasserstoffkatalyse in [FeFe]-Hydrogenasen

• Antragsteller: Professor Dr. Ulf-Peter Apfel; Professor Dr. Thomas Happe
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 436793189

[FeFe]-Hydrogenasen sind hocheffiziente H2-produzierende Biokatalysatoren und damit mögliche Blaupausen für die Entwicklung neuer synthetischer Katalysatoren zur H2-Produktion. Leider sind wesentliche Funktionsbereiche des aktiven Zentrums (H-Cluster) und dessen Proteinumgebung immer noch unverstanden. Dies betrifft vor allem die Aspekte des Protonengekoppelten Elektronentransports im Katalysemechanismus und das Problem der Sauerstoffempfindlichkeit dieser ansonsten hochproduktiven Enzymklasse. Diese Verständnislücken sollen hier durch den komplementären Einsatz von Molekularbiologie, Synthesechemie, Spektroskopie und Theorie im Rahmen eines erprobten multidisziplinären Kooperationsvorhabens geschlossen werden. Einerseits soll auf Basis von 25 ortsspezifischen Mutagenesevarianten eine mechanistische und räumliche Differenzierung zwischen regulativem und katalytischem Protonentransfer vorgenommen werden. Andererseits sollen in einem zeitaufgelösten „freeze-quench“ Verfahren für Wildtyp-Enzym und Mutagenese-Varianten des Protonentransfers Proben-Serien zur spektroskopischen Verfolgung des Prozesses der O2-abhängigen H-Cluster-Degradation gewonnen werden. Hierbei ermöglicht die Verwendung von 18O2 bei der H-Cluster Exposition eine massenspektrometrische Analyse (MS) der resultierenden Umsatzprodukte (CN18O-, C18O2 und H218O). Außerdem soll die O2-Resistenz eines der untersuchten Enzyme durch gezielte Verstärkung des Molekularsiebeffektes im Gaskanalsystem gesteigert werden, wobei ein größerer Variantenpool erzeugt und auf diesen Effekt durchmustert wird. Um ein umfassendes Gesamtbild zu erzeugen, kommen in allen Teilprojekten proteinbiochemische, kristallographische, enzymkinetische und spektroskopische Techniken (ATR-FTIR, XAS/XES, NRVS, FTIR, EPR und Mössbauer) sowie quantenmechanische Berechnungen zur Anwendung. Neben den Arbeiten am Protein sollen Element-Substitutionen in der H-Cluster-Architektur die individuellen Funktionen aller Liganden für den Reaktionszyklus aufklären und auf ihren Einfluss auf die Reaktivität (H+, e-, H2, O2) von [4Fe]H und [2Fe]H Subkomplexen getestet werden. Ein Austausch von Stickstoff im Brückenkopf des Dithiolat-Liganden gegen Phosphor könnte ggf. die Protonenleitfähigkeit des H-Klusters aufrechterhalten jedoch z.B. die Bildung reaktiver Sauerstoff-Spezies (ROS) unter O2 Kontakt vermeiden. Auch soll der Einfluss der Metall-Spezifität und Elektronendichteverteilung des H-Klusters auf die O2-induzierte H-Cluster-Degradation überprüft werden indem neuartige Metall-Homologe des [Fe2(adt)(CO)4(CN)2]2- Kofaktors durch das etablierte in vitro Maturationsverfahren in die Bindenische ausgewählter [FeFe]-hydrogenasen (CpI und HydA1) eingepasst werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Großgeräte: Stopped-Flow Freeze-Quench
• Gerätegruppe: 1120 Spezielle Reaktionsapparaturen (Blitzlicht-, Laser-, Photolyse, Stopped Flow)