Die Bedeutung des Lipidmilieus für Struktur-Funktionszusammenhänge bei NS5A und den Wirkmechanismus von NS5A Inhibitoren bei Hepatitis C
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In dieser Studie verwendeten wir einen Strukturinformatik-Ansatz und ein daraus abgeleitetes Mutagenesekonzept mit Phospholipiden als chemischen Sonden um Veränderungen des Konformationsraums und der Proteinfaltung des Nicht-Strukturproteins 5A des Hepatitis C Virus unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu testen. Wir konnten dabei eine neuartige Faltung des Proteins im Bereich des C-Terminus identifiziert, die bisher nicht in Kristallstrukturen gefunden wurde. Unser neues Faltungsmodell bestätigt die biologische Relevanz der ersten kristallographische beschriebenen Struktur der dimeren zinkbindenden Domäne 1 von NS5A, die ursprünglich 2005 von Timothy L. Tellinghuisen, Joseph Marcotrigiano & Charles M. Rice in Nature veröffentlicht wurde. Unser bioinformatischer Ansatz wird durch Ansätze aus der synthetischen Biologie, Assays zur Charakterisierung des Membranumbaus, zum Membrane remodeling, und kryogene Elektronenmikroskopie ergänzt. Während wir effektiv nach neuen NS5A-Modellen suchten, um die umfangreichen biologischen Daten zu diesem Protein und seiner komplexen Interaktion mit Lipiden aufzuklären, liefern wir mit unserem neuen Modell auch detaillierte mechanistische Einblicke in das Zusammenspiel von NS5A mit Phospholipiden, die die bisher zu diesem Thema veröffentlichten Daten über die Rolle von Phosphoinositidkinasen in der HCV-Replikation erklären können. Die neue Ausrichtung des C-Terminus in unserem Modell schafft eine Bindungstasche für Phosphatidylinositol-4-Phosphat (PI4P), die spezifisch die geladene Kopfgruppe des Lipids erkennt und den Proteinkern in einer biologisch relevanten symmetrischen Dimerfaltung an der Membranoberfläche ausrichtet und somit zur Dimerisierung und weiter zur Oligomerisierung maßgeblich beiträgt. Diese NS5A-Oligomere stellen das Gerüst für eine lineare RNA-Bindungsfurche dar und damit die Grundlage für die RNA-Replikation des Virus. Unsere Daten zeigen, dass die Charakterisierung membrangebundener Proteine außerhalb ihrer Lipidumgebung höchst artifiziell ist und solche Ansätze in ihrer Aussagekraft begrenzt sind. Wir konnten für NS5A klar belegen, dass spezifische Interaktion mit Phospholipiden zu Veränderungen der Proteinfaltung führen, die wiederum essenziell für das Protein trafficking innerhalb der infizierten Zelle sind und die Ausbildung von Replikationskomplexen und den Membranumbau steuern. Die Hemmung der spezifischen PI4P-Interaktion mit NS5A scheint auch ein Teil des bisher unbekannten Wirkmechanismus von NS5A-Inhibitoren zu sein. Unser mechanistisches Modell sagt erfolgreich solche Faltungsprozesse voraus und untermauert die RNA binding groove Hypothese und das initial von Tellinghuisen et al. publizierte Dimermodell.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Regulatory Role of Phospholipids in Hepatitis C Virus Replication and Protein Function. Pathogens, 11(1), 102.
Bulankina, Anna V.; Richter, Rebecca M. & Welsch, Christoph
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The role of serum sphingolipids as potential biomarkers of non‐response to direct acting antiviral therapy in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis, 30(2), 138-147.
Röhrig, Aissa Miriam; Jakobi, Katja; Dietz, Julia; Thomas, Dominique; Herrmann, Eva; Welsch, Christoph; Sarrazin, Christoph; Pfeilschifter, Josef; Zeuzem, Stefan & Grammatikos, Georgios
