In vitro Rekonstitution der Chromosomen-Separation mit Hilfe von optischen Pinzetten

• Antragsteller: Dr. Hannes Witt
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 438883799

Um während der mitotischen Zellteilung sicherzustellen, dass jede Tochterzelle das vollständige Genom erbt, nimmt die DNS der Zelle eine sehr kompakte, kondensierte Form an – das Metaphase-Chromosom. Obwohl das Metaphase-Chromosom von fundamentaler Bedeutung für eukaryotisches Leben ist, sind weder seine Struktur noch seine Dynamik komplett aufgeklärt.Das Ziel dieses Projektes ist mithilfe von optischen Pinzetten die Struktur und Mechanik von Metaphase-Chromosomen aufzuklären und schließlich die Separation der Geschwisterchromatide in vitro nachzustellen. Dadurch werden wir neue Erkenntnisse über die Struktur des Chromosomes gewinnen, verstehen wodurch die mechanischen Eigenschaften von Metaphase-Chromosomen auf molekularer Ebene bestimmt werden und zum ersten Mal die Möglichkeit haben, die Separation eines Chromosomes in Echtzeit mit molekularer Auflösung zu beobachten.Dazu werden wir gezielt Chromosomen mit Biotin funktionalisieren und dessen starke Wechselwirkung mit Avidin zur Befestigung von Polymer-Linkern an den Kinetochoren nutzen. Über orthogonale Funktionalisierungen der Linker können wir das Chromosom an Mikrokugeln befestigen, die wir in zwei optischen Fallen fangen. Auf diese Art können wir die mechanischen Eigenschaften des Metaphase-Chromosoms in der gleichen Geometrie untersuchen, die es auch in der mitotischen Spindel annimmt. Im nächsten Schritt soll die molekulare Zusammensetzung der Chromosomen kontrolliert beeinflusst werden, indem spezifisch strukturgebende Proteine -- hier vor allem die Proteinkomplexe Condensin I, II und Cohesin -- entfernt werden. Dadurch wird es möglich, ihre Funktion, sowie ihren Einfluss auf die Struktur, Dynamik und Mechanik der Chromosomen besser zu verstehenLetztendlich wollen wir die physiologische Separation der Geschwisterchromatide in vitro erreichen. Es ist bekannt, dass die beiden Enzyme Topoisomerase II und Separase dabei eine wichtige Rolle spielen. Unser Ziel ist die Frage zu beantworten, ob diese beiden Proteine ausreichend sind um alleine Chromosomen-Separation zu erzielen. Durch die Kombination von optischen Fallen und konfokaler Mikroskopie werden wir in der Lage sein, die Separation der Chromatide mithilfe von Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie in Echtzeit zu verfolgen.Dieses Projekt verfolgt einen vollständig neuen Ansatz die Struktur und Dynamik von Metaphase-Chromosomen zu verstehen und verspricht Erkenntnisse von herausragender Bedeutung, die nicht nur einen großen Einfluss auf die Molekularbiologie haben werden, sondern außerdem eine neue biophysikalische Perspektive auf Chromosomen-Separation eröffnen.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: Niederlande
• Gastgeber: Dr. Gijs Wuite