Aufklärung der genetische Interaktionen und Abhängigkeiten von mikroRNA-Biogenesefaktoren

• Antragsteller: Professor Dr. Tony Gutschner
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 440716364

Das RNase III-Enzym Dicer ist an der Biogenese von fast allen mikroRNAs (miRNAs) in menschlichen Zellen beteiligt. Seine Aktivität ist daher wichtig für die Aufrechterhaltung eines funktionellen miRNA-Netzwerkes, welches diverse zelluläre Prozesse, wie z.B. Proliferation, Migration, Zelltod und Differenzierungsvorgänge, kontrolliert. Während einige Studien bereits zeigen konnten, dass eine zellspezifische Entfernung des Dicer-Gens in der Maus toleriert wird, so ist es weitestgehend unklar wie menschliche Zellen auf einen teilweisen oder kompletten Verlust sämtlicher miRNAs durch Dicer-Deletion reagieren. Kürzlich veröffentlichten Studien, welche Dicer in immortalisierten oder transformierten humanen Zellen ausschalteten, konnten zeigen, dass diese Zellen lebensfähig sind, jedoch eine stark verminderte Wachstumsrate aufweisen. Die genauen molekularen Ursachen dieses Proliferationsdefekts sind jedoch weitestgehend unbekannt. In unseren Vorarbeiten haben wir Dicer in menschlichen Lungenkrebszellen mittel CRISPR/Cas9-basierten genome engineering ausgeschaltet. Diese Zellen zeigten ebenfalls ein verlangsamtes Zellwachstum und anschließende Transkriptomanalysen identifizierten eine Vielzahl deregulierter Gene und Signalwege. Um ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen zu erhalten, welche den beobachteten Phenotypen und veränderten Genexpressionsmustern zugrunde liegen, wollten wir einen funktionellen genetischen Screen durchführen und so die genetischen Interaktionen von Dicer, welche bisher unbekannt waren, entschlüsseln. Jedoch war die Analyse dieser Interaktionen in Dicer-defizienten Zellen mit Hilfe gepoolter, genomweiter small haipin (shRNA)-Bibliotheken nicht durchführbar, da shRNAs für ihre eigene Reifung und Aktivität Dicer benötigen. Aus diesem Grund haben wir das CRISPR/Cas9-System als komplementäres genetisches Werkzeug genutzt und genomweite loss-of-function Screens in Dicer Wildtyp- und Knockout-Zellen durchgeführt. Dieser Screening-Ansatz, zusammen mit unseren Genexpressionsdaten, hat eine neue regulatorische Verbindung zwischen Dicer und dem TGF-ß-Signalweg aufgedeckt. Unsere Daten legen nahe, dass Dicer, durch seine Funktion als miRNA-Biogenesefaktor, als Regler des TGF-ß-Signalweges fungiert und dessen Wirkung und das Schicksal der Zelle bestimmt. Unsere Erkenntnis, dass TGF-ß seine tumorfördernde Funktion umschaltet und in Abwesenheit von Dicer (und miRNAs) tumorsuppressiv wirkt könnte wichtige klinische Implikation haben. Dieser Projektantrag möchte daher die genetischen und molekularen Details dieser Interaktion aufklären sowie kritische miRNAs und deren relevanten Zielgene identifizieren. Dies könnte zur Entwicklung neuer Therapieansätze für die zukünftige Behandlung von Tumorerkrankungen führen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen