Molekulare Mechanismen des GPR124/RECK/WNT7 Signalwegs

• Antragsteller: Dr. Mario Vallon
• Fachliche Zuordnung: Anatomie und Physiologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 440925599

Der WNT7 Signalweg ist ein essentieller Regulator der ZNS Angiogenese und Blut-Hirn-Schranke (BHS). In Hirnendothelzellen ist dieser Signalweg hochspezialisiert und benötigt die WNT7-spezifischen Koaktivatoren GPR124 und RECK sowie die klassischen Wnt Rezeptoren FZD und LRP. Wir haben kürzlich entdeckt, dass dieser Signalweg auch in hyaloiden Endothelzellen des sich entwickelnden Auges, wo er die physiologische Regression hyaloider Blutgefäße vermittelt, dieselbe Spezialisierung zeigt. Persistenz hyaloider Blutgefäße nach der Geburt wird persistierender hyperplastischer primärer Vitreus (PHPV) genannt und kann zu beeinträchtigtem Sehvermögen und Blindheit führen. Die molekularen Mechanismen des GPR124/RECK/WNT7 Signalwegs in Hirn- und hyaloiden Endothelzellen sind noch nicht geklärt und werden aktiv von uns erforscht. Unsere Ergebnisse werden zur Grundlagenforschung und möglicherweise auch zur Entwicklung von Medikamenten beitragen, die (1) die BHS modulieren und/oder (2) dem PHPV entgegenwirken können. Das Projekt hat drei spezifische Ziele: Ziel 1 ist es die molekularen Mechanismen der GPR124/RECK/WNT7-vermittelten hyaloiden Blutgefäßregression im Mausmodell (Gpr124 KO Mäuse) zu untersuchen. Wir werden Einzelzell RNA Sequenzierungen durchführen, um Apoptose und Zielgene in hyaloiden Endothelzellen sowie potenziellen Crosstalk mit anderen Zelltypen des primären Vitreus (Perizyten, glatte Muskelzellen, Makrophagen) zu klären. Ziel 2 ist es GPR124/WNT7-abhängige Interaktionen von RECK mit anderen Proteinen auf der Zelloberfläche zu identifizieren. In der ersten Förderperiode haben wir ein Protokoll entwickelt um RECK Bindungspartner aus bEnd.3 Hirnendothelzellen zu isolieren. Dadurch konnten wir bereits 43 RECK-assoziierte Proteine identifizieren. 21 davon waren extrazelluläre bzw. Transmembranproteine, wie die bekannten RECK Bindungspartner GPR124 und ADAM10. Bei den anderen 19 Proteinen könnte es sich um neue, direkte oder indirekte RECK Bindungspartner handeln. In der zweiten Förderperiode werden wir diese RECK-assoziierten Proteine validieren und unser etabliertes System weiter nutzen um potenziell GPR124/WNT7-abhängige RECK Interaktionen zu identifizieren. Ziel 3 ist es zu klären welche FZD Isoformen (FZD1-10) das GPR124/RECK/WNT7 Signal übertragen. Während der ersten Förderperiode haben wir bereits Fzd4, 5, 6 und 8 Einzel-KO bEnd.3 Zellen generiert. Keiner dieser KOs beeinträchtigte jedoch den WNT7 Signalweg. In der zweiten Förderperiode werden wir Einzel-KOs der anderen Fzd Gene und verschiedene Fzd Kombinations-KOs generieren. Um relevante FZD Isoformen zu identifizieren, werden wir Ko-Pulldown Assays mit rekombinantem FZD1-10 und WNT7 konditioniertem Medium durchführen. Basierend auf den Ergebnissen werden wir Einzel- und Kombinations-KOs aller FZD Rezeptoren generieren, die (1) WNT7 Liganden binden und (2) in bEnd.3 Zellen exprimiert werden. Die KO Zellen werden dann mittels Wnt Reportergen Assay auf Defekte im WNT7 Signalweg untersucht.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen