Investigation of the Membrane Anchor of Human N-Ras by Experimental Approaches, Analytical Models and Molecular Dynamics Simulations
Final Report Abstract
Das humane N-Ras Protein ist ein membrangebundenes Protein, das die Rolle eines molekularen Schalters bei der Signalübertragung übernimmt und aufgrund der Beobachtung, dass in 30% aller menschlichen Tumore mutierte Varianten dieses Proteins gefunden werden, von großem medizinischem Interesse ist. Während die lösliche Domäne des Proteins zum Zeitpunkt der Antragstellung bereits sehr gut charakterisiert war, war nur wenig über den für die Funktion des Proteins essentiellen Membrananker bekannt, welcher in diesem Forschungsprojekt genauestens charakterisiert wurde. Der Membrananker des humanen N-Ras Proteins, welcher aus den C-terminalen sieben Aminosäuren und zwei kovalent daran gebundenen Lipidmodifikationen besteht ist insgesamt durch eine überraschend hohe Flexibilität und Beweglichkeit charakterisiert. Die Lipidmodifikationen weisen große Bewegungsamplituden auf und sind Lipiden in Anwesenheit von Detergenzien sehr ähnlich. Die Dynamik des Membranankers wurde mittels eines anisotropen Rotationsdiffusionstensors modelliert dessen Hauptachsen zu DP = 8.5 × 10 9 s −1 und DS = 4.2 × 10 5 s −1 bestimmt wurden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sich die Lipidmodifikation in ihrer Länge der umgebenden Membran nahezu perfekt anpassen. Das Peptidrückgrat ist ebenfalls durch große Bewegungsamplituden gekennzeichnet. Mittels eines modifizierten Lipari-Szabo Ansatzes konnten für alle Aminosäuren Korrelationszeiten von ~1ns für schnelle Bewegungen und hunderten von ns für langsame Bewegungen bestimmt werden, was in guter Übereinstimmung mit den oben genannten Werten für die Rotationsdiffusionskonstanten ist. Bei der Untersuchung der Struktur des Peptidrückgrats zeigte sich, dass diese hohe Beweglichkeit dazu führt, dass nicht nur eine Struktur sondern ein Ensemble von Strukturen vorliegt, das sich in einem dynamischen Gleichgewicht befindet. Dabei spielen vor allem die Aminosäuren Cys 181 und Met 182 eine entscheidende Rolle, da sie ihre Konformation kollektiv ändern. Die zwei „Hauptstrukturen“ des Peptidrückgrats wurden bestimmt und mit drei bereits bekannten experimentell erhaltenen Strukturmodellen verglichen. Dabei konnte eines der Strukturmodelle bestätigt werden, während die zweite „Hauptstruktur“ keiner der experimentellen Strukturen ähnelte. Weiterhin wurde untersucht ob sich Ras in bestimmte Membrandomänen, sogenannte Rafts, einlagert. Es wird oft spekuliert, dass die damit verbundene Erhöhung der lokalen Konzentration für die Aktivierung von Proteinen benötigt wird. Während bisher davon ausgegangen worden war, dass sich N-Ras in Rafts befindet, konnte gezeigt werden, dass es stattdessen die flüssig-kristalline Phase bevorzugt und sich vor allem in der Grenzfläche der Domänen anreichert.
Publications
- “Flexibility of Ras lipid modifications studied by 2H solid-state NMR and molecular dynamics simulations”, Biophys.J. 93, 2697–2712, 2007
Alexander Vogel, Scott E. Feller, Catherine P. Katzka, Herbert Waldmann, Michael F. Brown, Daniel Huster
- „Backbone conformation and dynamics of the lipid-modified membrane anchor of human N-Ras investigated by solid-state NMR and molecular dynamics simulations“, Biophysical Society Meeting 2008, Biophysical Journal 94, 891A, 2008
Alexander Vogel, Guido Reuther, Kui-Thong Tan, Herbert Waldmann, Scott E. Feller, Daniel Huster
- „Lipid bilayer dynamics investigated by combined solid-state NMR relaxation and molecular dynamics simulations“, Biophysical Society Meeting 2008, Biophysical Journal 94, 15A, 2008
Alexander Vogel, Daniel Huster, Andrey V. Struts, Scott E. Feller, Michael F. Brown
- “Backbone conformation and dynamics of the lipid-modified membrane anchor of human N-Ras investigated by solid-state NMR and molecular dynamics simulations”, Biophysical Society Meeting 2009, Biophysical Journal 96, 198A, 2009
Alexander Vogel, Guido Reuther, Kui-Thong Tan, Herbert Waldmann, Michael F. Brown, Scott E. Feller, Daniel Huster
