CRISPR-basierte funktionelle Genomik für Untersuchungen zur Regulation der Zellantwort auf Pertubation der Funktion von mutiertem RAS im Multiplen Myelom: biologische und therapeutische Implikationen.

• Antragsteller: Dr. Torsten Steinbrunn
• Fachliche Zuordnung: Hämatologie, Onkologie
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 442740310

Das RAS-Onkogen ist in bis zu 40% der Patienten mit Multiplem Myelom (MM) mutiert und vermittelt Tumorzellwachstum und -überleben. In meinen Vorarbeiten zeigte ich die Abhängigkeit der MM-Zellen von der jeweils mutierten KRAS- oder NRAS-Isoform durch Unterdrücken der Expression mittels RNA-Interferenz, was Zelltod selektiv in RAS-mutierten Zellen auslöste. Weitere mit RAS potentiell assoziierte Signalwege (z.B. RAF/MAPK, RAL-GTPase, PI3K/Akt) vermittelten MM-Zellüberleben, jedoch waren diese Effekte unabhängig von onkogenem RAS. Somit stellt die direkte Hemmung von onkogenem RAS ein wichtiges translationales, aber mangels geeigneter pharmakologischer Inhibitoren bislang unerreichtes Ziel dar. Seit kurzem existieren jedoch neuartige Small-Molecules, die spezifisch mutiertes KRAS(G12C) hemmen und in Vorversuchen von Prof. Mitsiades’ Labor starken Zelltod in MM-Zellen mit dieser Mutation auslösten. Mit diesen Inhibitoren werden wir funktionelle Zusammenhänge, Resistenzmechanismen und Interaktionspartner in Abhängigkeit von der onkogenen RAS-Aktivität in MM-Zellen untersuchen. Diese Ergebnisse werden auch für weitere Mutationen relevant sein und direkte translationale Anwendbarkeit finden, sobald Inhibitoren für derzeit noch nicht hemmbare Mutationen verfügbar werden.Wir werden spezifische Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-basierte Methoden durchführen, um mit Genom-weiten Loss-of-Function (LOF)- bzw. Gain-of-Function (GOF)-Studien Gene zu identifizieren, die unter pharmakologischer oder genetischer RAS-Inhibition zur Sensitivierung vs. Resistenzbildung im MM führen. Die Kandidatengene werden mit Subgenom-weiten sgRNA-Librarys in fokussierten CRISPR-Analysen validiert. Um den Einfluss des Knochenmark(KM)-Mikromilieus darzustellen, erfolgen diese Untersuchungen in der MM-Zellkultur vs. Co-Kultur mit KM-Stromazellen von MM-Patienten sowie in vivo in einem humanisierten KM-ähnlichen Mausmodell. Aus dualen sgRNA-library-basierten CRISPR-Studien, in denen statt einem Gen jeweils paarweise Kombinationen aus zwei Genen pro Zelle abgeschaltet (LOF) oder aktiviert (GOF) werden, lassen sich zudem Vorhersagen zu RAS-abhängigen Signalwegsinteraktionen (Crosstalk, Feedback) und rationalen Kombinationstherapien (Synergismus, Antagonismus) treffen.Mittels Biotin-gelabelter Proteinidentifikations-Assays (BioID) in MM-Zellen mit bisher nicht hemmbaren RAS-Mutationen (z.B. G12D, Q61H) werden wir Interaktionspartner identifizieren, die sich auch ohne direkte Bindung oder dauerhafte Präsenz in unmittelbarer räumlicher Nähe zu onkogenem RAS befinden. Neue therapeutische Zielstrukturen werden wir dann mittels fokussierter CRSPR-Analyse validideren und als potentielle Kombinationspartner oder Resistenzvermittler charakterisieren. Diese Plattformen werde ich nach meiner Rückkehr nach Deutschland weiterentwickeln, um sie auf genomische Daten funktionell anzuwenden, die translationale Relevanz über mutiertes RAS und das MM hinaus besitzen.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeber: Professor Constantine Mitsiades, Ph.D.