Strukturelle und funktionelle Untersuchung des humanen CLC-7/OSTM1 Komplexes

• Antragstellerin: Dr. Marina Schrecker, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 443618349

Die Familie der Chloridkanäle (CLC) ist in allen Domänen des Lebens vertreten. Säugetiere besitzen neun unterschiedliche CLC-Proteine. Der Chlorid-Protonen-Antiporter CLC-7 ist das am häufigsten vorkommende CLC-Protein in Lysosomen, Endosomen und in der vesikelreichen Zone der Osteoklasten (ruffled border).Die Mutationen des Proteins CLC-7 führen sowohl bei Mäusen als auch beim Menschen zur Osteopetrose und zu lysosomalen Speicherkrankheiten. Der CLC-7-Transporter weist typische Strukturmerkmale der CLC-Familie auf, darunter die dimere Topologie und der Aufbau der Ionentranslokationsstelle. Zudem besitzt der CLC-7-Antiporter eine für die CLC-Familie charakteristische Stöchiometrie und transloziert zwei Chloridionen gegen ein Proton. Allerdings besitzt das CLC-7-Protein einige besondere Merkmale, durch die es sich von den anderen CLC-Mitgliedern unterscheidet. So besitzt CLC-7 im Vergleich zu den übrigen CLC-Proteinen eine deutlich langsamere, spannungsabhängige Aktivierungs- und Deaktivierungsrate. Weiterhin ist CLC-7 das einzige Mitglied der CLC-Familie, dessen Stabilität und Aktivität von der Interaktion mit einem Partnerprotein, nämlich dem Osteopetrose-assoziierten Transmembranprotein 1 (OSTM1), abhängt. OSTM1 besteht aus einer größeren, hochgradig glykosylierten N-terminalen Domäne, einer einzelnen transmembranen Domäne und einem kurzen unstrukturierten C-Terminus. CLC-7-, OSTM1- und CLC-7/OSTM1-defiziente Mäuse haben eine kurze Lebenserwartung und entwickeln lysosomale Speicherkrankheiten, Osteopetrose und Netzhautdegeneration.Der Regulationsmechanismus des CLC-7/OSTM1-Komplexes ist bislang unbekannt. Diese Frage soll nun mit einer Kombination aus strukturbiologischen, elektrophysiologischen und biochemischen Methoden geklärt werden. Während der ersten Monate im Gastgeberlabor habe ich bereits das Reinigungsprotokoll für CLC-7 aus Gallus gallus etabliert. Die gereinigte Probe habe ich mittels Kryoelektronenmikroskopie (cryo-EM) analysiert und es konnten über drei Millionen Proteinpartikel identifiziert werden. Als nächstes plane ich Untersuchungen am humanen CLC-7-Protein (Zielsetzung 1) sowie am humanen CLC-7/OSTM1-Komplex (Zielsetzung 2). Der Vergleich der cryo-EM-Strukturen von CLC-7 und Gesamtkomplex wird wichtige regulatorische Regionen identifizieren und zu einem besseren Verständnis des einzigartigen Regulationsmechanismus von CLC-7 beitragen. Weiterhin werde ich den Regulationsmechanismus von CLC-7 mittels Fluoreszenz-basierter Transportanalyse von Lipid-rekonstituierten CLC-7- und CLC-7/OSTM1-Proben untersuchen. Insgesamt werden die geplanten Untersuchungen Aufschluss über den Regulationsmechanismus von CLC-7/OSTM1 geben, und zum Verständnis der physiologischen und pathologischen Bedeutung des CLC-7/OSTM1 Komplexes beitragen.

• DFG-Verfahren: WBP Stipendium
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeber: Dr. Richard K Hite