Strukturelle und funktionelle Untersuchung des humanen CLC-7/OSTM1 Komplexes
Strukturbiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Vergleich zu den anderen CLC-Transportern der Säugetiere, benötigt CLC-7 die β- Untereinheit, OSTM1, für die Transportaktivität[1, 2]. Beide Proteine sind in den Lysosomen und Osteoklasten lokalisiert, wo sie sich gegenseitig stabilisieren und den Austausch von Cl -/H+ ermöglichen. OSTM1 besteht aus einer Transmembranhelix, umgeben von C- und N-terminalen Loops. Mutationen in CLC-7 und OSTM1 stehen in Verbindung mit Osteopetrose und Neurodegeneration. Allerdings bleibt unklar, wie der Ionentransport von OSTM1 abhängig ist. Um diese Frage zu klären, haben wir die Kryo-EM-Strukturen von CLC-7 und CLC-7 im Komplex mit OSTM1 untersucht. Die gelösten Strukturen demonstrieren, wie das stark glykosylierte OSTM1 in den lysosomalen Lumen reicht, um CLC-7 vor der saureren Umgebung zu schützen. Die Analyse zeigt die konservierten Nukleotid- und PI-Lipiden-Bindungsstellen in der CLC-Familie und hypothetisiert, dass die Konformation der Poren für Cl - und H +-Ionen von OSTM1 beeinflusst werden. Die Strukturen offenbaren konservierte Bindungsstellen für ATP und Phosphatidylinositol, was darauf hindeutet, dass neben den bereits bekannten Regulationsfaktoren wie dem Membranpotential und dem pH-Wert auch weitere Faktoren die Transportregulation beeinflussen könnten. Während ATP als konstitutiv gebundener Ligand eine strukturelle Rolle spielt, haben Mutationen an der Nukleotid-Bindungsstelle funktionelle Auswirkung auf CLC-7. Ein weiteres Molekül, das in den CLC-7 und CLC-7/OSTM1 Strukturen identifiziert wurde ist Phosphatidylinositol 3-phosphate (PI3P). Obwohl PI3P bisher nicht als Regulator der Aktivität von Ionentransportproteinen von CLC-7 bekannt war, reguliert Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate (PI(3,5)P2) CLC-a von Arabidopsis thaliana. Wir identifizierten konservierte Reste, die für die Koordination von PI3P zuständig sind; diese Aminosäuren sind auch in CLC -6 vorhanden. PI(3,5)P2 hemmt die Aktivität von CLC-a. Um die Auswirkungen von PI(3,5)P2 auf CLC-7 zu untersuchen, modellierten wir ein PI(3,5)P2-Molekül in die Bindungsstelle der CLC- 7/OSTM1. Ein Phosphat an der 5-Position des Inositolrings kollidierte dabei mit dem Protein. Wir vermuten, dass die Bindung von PI(3,5)P2 Konformationsänderungen in CLC-7 verursachen, und somit zu einem inhibierenden Effekt auf die Aktivität von CLC-7 haben könnten. Nach der Veröffentlichung meiner Ergebnisse in eLife entdeckte eine andere Gruppe, dass das lysosomale PI(3,5)P2 die Aktivität vom CLC-7/OSTM1 Komplex hemmt. Diese Ergebnisse bestätigen unsere Hypothesen bezüglich der regulatorischen Rolle von PI -Lipiden für das CLC- 7/OSTM1-Komplex und der Homöostase der Lysosomen. Zusätzlich zu meinem Hauptprojekt untersuchte ich in Kooperation mit der Gruppe von Dr. Dirk Remus aus MSK, wie die DNA-Ringklemmenproteine auf spezifische DNA-Segmente selektiv geladen werden. Die Ringklemmenproteine, wie das bekannte PCNA, spielen eine entscheidende Rolle bei der Rekrutierung wichtiger DNA-modifizierender Enzyme für die DNA- Replikation und -Reparatur. Aufgrund fehlender Strukturen eines eukaryotischen Ringklemmenprotein-Ladekomplexes in Anwesenheit von DNA war ihr genauer Mechanismus bisher ungewiss. Unsere Forschung zeigte, wie das 9-1-1-Checkpoint-Ringklemmenprotein spezifisch mit der beschädigten DNA interagiert, um die ATR-Kinase zu aktivieren und den Checkpoint der DNA-Schadensantwort einzuleiten. Wir identifizierten die spezifische Erkennung von DNA am 5'-Sticky ends durch den Rad17-Checkpoint-Ringklemmenprotein-Ladekomplex. Diese charakteristische DNA-Sequenz entsteht häufig nach DNA-Schäden oder im Zuge des Kollapses der Replikationsgabel. Die DNA-Erkennungssequenz verursacht einen globalen Konformationswechsel im Rad17-Checkpoint-Ringklemmenprotein-Ladekomplex, was zum Öffnen des 9-1-1-Ringklemmenproteins führt, somit wird das Laden von DNA ermöglicht. Unsere Studie brachte ein neues Verständnis für die Erkennung einzigartiger DNA-Strukturen. Zusätzlich haben wir das Laden der kanonischen Ringklemmenprotein, PCNA, auf DNA mit 3'- Sticky ends untersucht. Unsere Studie demonstrierte den mehrstufigen Prozess, durch den DNA auf PCNA geladen wird, und löste langjährige Kontroversen auf diesem Gebiet.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Cryo-EM structure of the lysosomal chloride-proton exchanger CLC-7 in complex with OSTM1. eLife, 9.
Schrecker, Marina; Korobenko, Julia & Hite, Richard K.
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Presentation: ‚Structural and functional investigation of the human CLC-7/OSTM1 complex‘ during Molecular Biophysics Training Program annual Seminar in June 2020 at WCM in New York, NY.
Marina Schrecker
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Mechanisms of loading and release of the 9-1-1 checkpoint clamp. Nature Structural & Molecular Biology, 29(4), 369-375.
Castaneda, Juan C.; Schrecker, Marina; Remus, Dirk & Hite, Richard K.
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Multistep loading of a DNA sliding clamp onto DNA by replication factor C. eLife, 11.
Schrecker, Marina; Castaneda, Juan C.; Devbhandari, Sujan; Kumar, Charanya; Remus, Dirk & Hite, Richard K.
