Genom- und RNA-Sequenzierung in 25 Familien mit von einer Mendel'schen Erkrankung betroffenen Person/en

• Antragstellerin: Professorin Dr. Kerstin Kutsche
• Fachliche Zuordnung: Humangenetik
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 443716202

Mit der Hochdurchsatzsequenzierung, zu der whole-exome sequencing (WES) und whole-genome sequencing (WGS) zählen, wurde die Aufdeckung genetischer Ursachen für monogene Erkrankungen revolutioniert. WES und WGS sind höchst sensitiv gegenüber der Detektion von single nucleotide variants (SNVs) und small insertions and/or deletions (indels). Durch Trio-WES wird eine Aufklärungsrate von ~40% erreicht, die durch computergestützte Analysen von copy number variants (CNVs) um 2-10% gesteigert werden kann. WGS hat gegenüber WES entscheidende Vorteile, wie die gleichmäßige Datenqualität über das gesamte Genom hinweg und den Zugang zu bestimmten Varianten. Hierzu gehören Varianten in Promotor- und untranslatierten Regionen von proteinkodierenden Genen, solche in RNA-Genen und nicht-kodierenden Regionen sowie strukturelle Varianten (SVs) wie Inversionen und Translokationen. Mit der Aufdeckung von 4-5 Millionen Varianten pro Genom wächst die Schwierigkeit der systematischen Variantenpriorisierung. Komplementär zu WGS kann RNA sequencing (RNA-seq) eingesetzt werden, wodurch aberrante Transkripte sowie eine differentielle und/oder monoallelische Expression eines Gens aufgedeckt werden können. Aktuelle Studien zeigen, dass RNA-seq ein unverzichtbarer Begleiter von WGS ist, um eine erfolgreiche Priorisierung und Interpretation der Millionen Varianten zu erreichen.In dem hier beantragten Vorhaben wollen wir die genetischen Ursache in 25 Familien, in denen eine/mehrere Person/en eine monogene Erkrankung und keine durch WES gestellte genetische Diagnose haben, identifizieren und damit zur Aufklärung neuer Krankheitsgene beitragen. Zunächst werden vorhandene Exom-Daten von 42 Betroffenen mittels verschiedener computergestützter Algorithmen auf das Vorliegen von möglichen pathogenen CNVs analysiert. Bei 25 klinisch gut charakterisierten Patienten ohne genetische Diagnose und Eltern wird anschließend WGS durchgeführt. Die Filterung und Priorisierung der Varianten erfolgt stufenweise nach (i) in proteinkodierenden und Spleiß-Regionen lokalisierten SNVs/indels, (ii) CNVs und SVs, die exonische, proteinkodierende und Spleiß-Regionen umfassen, und (iii) de novo vorliegenden nicht-kodierenden Varianten in putativ regulatorischen Regionen. Hierfür werden verschiedene bioinformatische Methoden evaluiert und etabliert. Validierung und Segregation der genetischen Varianten erfolgt durch klassische molekulargenetische Methoden. Mit Hilfe von RNA-seq an RNA aus Fibroblasten der 25 o.g. Patienten sollen fehlgespleißte mRNAs und monoallelisch/differentiell exprimierte Gene aufgedeckt werden. Durch die Integration von WGS- und RNA-seq-Daten sollen potentiell krankheitsrelevante Varianten herausgefiltert werden. Mit dem Auffinden von Kandidatengenen wird international nach weiteren Betroffenen gesucht. Die funktionellen Auswirkungen verschiedener Varianten auf das Genprodukt und assoziierte Signalwege werden durch biochemische und zellbiologische Assays untersucht.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen