Assemblierungsstadien und Strukturen des Tat Translokons

• Antragsteller: Professor Dr. Thomas Brüser
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 444687508

Das "twin-arginine translocation" (Tat) System dient dem Transport gefalteter, häufig Cofaktor-beinhaltender Proteine über energetisierte Membranen von Bakterien, Archaeen, Plastiden und auch einigen Mitochondrien. Tat-abhängig transportierte Proteine werden mit einem Transport-vermittelnden N-terminalen Signalpeptid synthetisiert, welches das namengebende Zwillingsargininmotiv (twin-arginine motif) beinhaltet. Der Tat-Weg ist für photosynthetische und viele respiratorische Redoxwege essentiell und erlangt auch dadurch besondere Bedeutung, dass er für die Virulenz vieler pathogener Bakterien benötigt wird, darunter solch wichtige Arten wie Mycobacterium tuberculosis oder Pseudomonas aeruginosa. Eine zentrale Frage der gegenwärtigen Tat-Forschung ist, wie das Tat-System mechanistisch den Transport von Proteinen erlaubt, die im Durchmesser sogar größer als Membrandicken sein können. Tat-Translokons setzen sich aus vielen Kopien zumindest zweier verschiedener Proteine zusammen, einem der TatAB Proteinfamilie und einem TatC. Der intensiv untersuchte Modellorganismus Escherichia coli bildet voll aktive Tat-Translokons aus den drei Untereinheiten TatA, TatB und TatC. Wir haben die Assemblierung aktiver TatABC Translokons untersucht und konnten dabei mittels "blue-native polyacrylamide gel electrophoresis" (BN PAGE) drei substratfreie Tat-Komplexe (Tat complex TC1, TC2, TC3) und zwei substratassoziierte Komplexe (TC1S, TC2S) unterscheiden. Basierend auf diesen und vorherigen Daten haben wir ein Modell für die Assemblierungsschritte und die damit einhergehende Abfolge der Translokationsereignisse entwickelt. In diesem Projekt wollen wir die verschiedenen Tat-Komplexe mittels gerichteter Mutagenese in Kombination mit gerichteter Quervernetzung differenzieren. Wir haben bereits einige Mutationen identifiziert, welche Tat-Komplexe bestimmter Typen selektiv anreichern. Diese Veränderungen der anteiligen Verhältnisse der Komplexe erlauben nun die Identifizierung Komplex-spezifischer Quervernetzungen. Der erste Teil des Projektes konzentriert sich auf diese Aspekte und wird dabei die Analysen auf mehr Positionen ausdehnen, was schließlich zur Bestimmung von Änderungen des Translokon-Status unter verschiedenen Bedingungen und Wachstumsphasen genutzt werden wird. Der zweite Teil des Projektes fokussiert sich auf die biochemische und strukturelle Analyse gereinigter Tat-Komplexe. Für Reinigungen in Mengen, welche die Bestimmung von Substratbindeparametern, Untereinheiten-Stöchiometrieen oder Cryo-EM Strukturen erlauben, sollen die Tat-Komplexe mit verschiedenen Methoden stabilisiert werden, darunter sowohl Quervernetzungsmethoden als auch neuartige Detergens-freie Solubilisierungsmethoden. Zusammen werden beide Teile des Projektes dazu beitragen, den immernoch rätselhaften Mechanismus des faszinierenden Transports vollständig gefalteter Proteine über biologische Membranen zu verstehen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen