Pathophysiologie der Glutarazidurie Typ 1
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Voruntersuchungen zeigten, dass das mitochondriale Matrixenzym Glutaryl-CoA-Dehydrogenase (GCDH) neben der bekannten Homotetramer-Bildung auch Interaktionen mit bislang unbekannten Proteinen eingeht. Im Rahmen des geförderten Projektes konnten mittels GCDH-Affinitätschromatographie und anschließenden massenspektrometrischen Analysen 10 GCDH-interagierende Proteine identifiziert werden. Die Bindung von GCDH an Dihydrolipoamid-S-Succinyltransferase (DLST) und an die β-Untereinheit des Elektronentransferierenden Flavoproteines (ETFB) konnte mit zwei unabhängigen Methoden (Co-Präzipitationsexperimente und Protein-Komplementations-Assay) in vitro und in vivo verifiziert werden. Eine Reihe bei GA1-Patienten beschriebener GCDH-Mutationen sind nicht im katalytischen Zentrum bzw. der Substratbindungsstelle lokalisiert, sondern projizieren auf die Oberfläche des GCDH-Proteins. Daher ist ein Einfluss dieser Mutanten auf die Interaktion mit anderen Proteinen möglich. Einige dieser Mutationen (p.Gly117Arg, p.Met191Thr, p.Pro248Leu, p.Met263Val und p.Arg255His) wurden hinsichtlich ihres Einflusses auf die Bindung an DLST untersucht. Allerdings zeigte sich in Co-Präzipitationsexperimenten bei keiner der untersuchten Mutanten im Vergleich zu Wildtyp-GCDH eine Reduktion in der Bindung von GCDH an DLST. Untersuchungen weiterer, an der Oberfläche des GCDH-Proteines gelegenen Mutanten sind geplant, um die DLST- Bindungsstelle zu lokalisieren und die Bindung näher zu charakterisieren. Da es sich bei DLST um die E2-Untereinheit des 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplexes handelt, wäre denkbar, dass auch GCDH Teil eines Multienzymkomplexes ist, in dem die Wechselwirkungen der Proteine untereinander regulativen Einfluss auf die Aktivität der einzelnen katalysierten Schritte ausüben. Diese weiterführenden Analysen sind Gegenstand der sich anschließenden, bereits laufenden Einzelförderung. In Voruntersuchungen wurden der Natrium-abhängige Dicarboxylat-Cotransporter (NaC) 3 und der Organische Anionentransporter (OAT) 1 als basolaterale und OAT4 als apikaler Transporter an renalen proximalen Tubuluszellen für die bei der GA1 akkumulierenden Metaboliten GA bzw. 3OHGA identifiziert. Um die Bedeutung dieser Transporter in vivo zu analysieren, wurde die mRNA- sowie Protein-Expression von NaC3 und Oat1 in Gcdh-/- Mäusen unter basalen Bedingungen und während der induzierten metabolischen Krise untersucht. Hierbei zeigte sich auf Proteinebene ein Anstieg der Oat1-Expression bei Gcdh-/- Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Tieren, der sich in der metabolischen Krise noch verstärkte. Immunfluoreszenz-Analysen belegten zudem, dass es zu einer partiellen Umverteilung von Oat1 von der basolateralen zur apikalen Membran proximaler Tubuluszellen kam. Überraschenderweise konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass es dabei zu einer Schädigung der apikalen Bürstensaummembran kam. Dieser Befund ließ sich in histologischen Untersuchungen bestätigen. Zudem zeigten elektronenmikroskopische Studien, dass sich die Mitochondrien in renalen proximalen Tubuluszellen von Gcdh-/- Mäusen während der induzierten metabolischen Krise im Vergleich zu basalen Bedingungen bzw. zu Wildtyp-Tieren deutlich vergrößert, balloniert und mit reduzierter Elektronendichte darstellen. Dies ist ein Hinweis auf eine mitochondriale Schädigung dieser Zellen im Rahmen der induzierten metabolischen Krise, mit der Folge eines Energiemangels und einer Schädigung der proximalen Tubuluszellen. Untersuchungen des Urins zeigen, dass es bei Gcdh-/- Mäusen während der induzierten metabolischen Krise zu einer low molecular weight Proteinurie als Zeichen einer Tubulopathie kommt. Diese Ergebnisse stellen die erstmalige Beschreibung einer möglichen Nierenschädigung im Tiermodell der GA1 dar. Sorgfältige Studien an GA1-Patienten sind notwendig, um zu untersuchen, ob es im Langzeitverlauf bei GA1-Patienten ebenfalls zu strukturellen oder funktionellen Schädigungen an der Niere kommen kann.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2010): Disease-related glutaric and 3-hydroxyglutaric acids impair the transport of succinate from astrocytic to neuronal cells. 1st World Congress on Targeting Mitochondria, Berlin, 18.-19.11.2010
Lamp J, Keyser B, Ullrich K, Braulke T, Mühlhausen C
- (2011): Glutaric aciduria type 1 metabolites impair the succinate transport from astrocytic to neuronal cells. J Biol Chem 286:17777-17784
Lamp J, Keyser B, Koeller DM, Ullrich K, Braulke T, and Mühlhausen C
- (2011): Glutaric aciduria type 1: disease-related metabolites impair the succinate transport from astrocytes to neurons. The 3rd EMBO Meeting, Wien, 10.-13.9.2011
Lamp J, Keyser B, Ullrich K, Braulke T, Mühlhausen C
- (2012): Interaction of glutaric aciduria 1-related GCDH with mitochondrial matrix proteins. J Inherit Metab Dis 35 (Suppl 1):S61. Annual Symposium of the Society for the Study of Inborn Errors of Metabolism (SSIEM), Birmingham, 4.-7.9.2012
Lamp J, Braulke T, Mühlhausen C
