Die Konsequenzen von unplanmäßiger DNA Replikation

• Antragsteller: Professor Dr. Boris Pfander
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 445098914

Kontrollmechanismen spielen bei DNA-Replikation eine wichtige Rolle, um die Herstellung einer exakten Kopie des Genoms sicher zu stellen. Das Genom soll genau einmal pro Zellzyklus verdoppelt werden. Im Falle von unplanmäßiger Replikation wird ein Replikationsstress ausgelöst, dessen genauer Mechanismus jedoch weitgehend unbekannt ist. Replikationsstress selbst ist die wesentliche Triebkraft von Genom-Instabilität in gesunden Organismen, aber auch während der Krebsentstehung. Die Ursachen dieses Stresses sind dabei variabel. Momentan mangelt es an einem molekularen Marker zur Unterscheidung unterschiedlicher Formen von Replikationsstress. In unserer vorangegangenen Arbeit haben wir verschiedene Saccharomyces cerevisiae Modelsysteme etabliert, mit welchen unplanmäßige Replikation in der G1-Phase ausgelöst werden kann. Damit ist es uns gelungen, DNA-Replikation vor der S-Phase mechanistisch zu charakterisieren, wie auch Faktoren welche ihr entgegenstehen. Zudem konnten wir mithilfe dieser Systeme den Zusammenhang zwischen unplanmäßiger Replikation, Replikationsstress und Genom-Instabilität aufklären. Unsere Daten aus molekularbiologischen und NGS-Experimenten zeigen, dass unplanmäßige Replikation eine sogenannte Über-Replikation bedingt, welche wiederum zu Replikations-Kollisionen und DNA-Brüchen führt. Für diese Erkenntnisse war insbesondere die DNA-Strang-spezifische Kartierung von Einzelstrang-DNA entscheidend. In den Einzelstrang-DNA-Signaturen sehen wir des Weiteren das Potenzial die Differenzierung zwischen unterschiedlichen Formen von Replikationsstress zu ermöglichen. In der Fortsetzung dieses Projekts werden wir (i) den vorgeschlagenen Mechanismus mittels Einzel-Zell und Einzel-Molekül-Techniken, sowie NGS-Ansätzen überprüfen. Außerdem werden wir der Frage nachgehen, ob Replikations-Kollisionen und DNA-Brüche der Hauptmechanismus nach unplanmäßiger Replikation sind, oder ob weitere Mechanismen zum Phänotyp beitragen. Methodisch werden wir (ii) den ssDNA-seq Ansatz weiterentwickeln. Das Ziel dieses Ansatzes ist es, Einzelstrang-DNA quantitativ, hochauflösend und mit Daten für die Länge der Einzelstrang-Abschnitte zu vermessen. Zudem (iii) wollen wir einen Katalog von Einzelstrang-DNA-Signaturen erstellen. Hierfür werden wir unterschiedliche Formen von Replikationsstress im Hefe-Modell, aber auch in humanen Zellen, induzieren und Einzelstrang-DNA vermessen. Wir wollen weiterhin testen, ob die Einzelstrang-Signatur es uns erlaubt, unplanmäßige Replikation unter Bedingungen eines deregulierten Zellzyklus zu detektieren. Das Projekt wird also nicht nur unser Verständnis für den Zusammenhang zwischen unplanmäßiger Replikation und Genom-Instabilität schärfen, sondern uns auch eine neuartige Möglichkeit für die Unterscheidung verschiedener Replikationsstress-Phänomene eröffnen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen