Anwendung natürlich vorkommender Polymorphismen in Phytochrom A zur Untersuchung der Sequenz/Funktion Beziehung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Phytochrom A (phyA) ist ein wichtiger Photorezeptor in Pflanzen, der eine wesentliche Rolle für die Etablierung von Keimlingen in starkem Vegetationsschatten spielt, wo das verfügbare Lichtspektrum von dunkelrotem Licht dominiert wird. PhyA ermöglicht Pflanzen auch, sehr schwaches Licht oder kurze Lichtreize, wie z. B. bei der Bodenbearbeitung, wahrzunehmen und darauf zu reagieren. Im Rahmen des durchgeführten Projekts haben wir die 1001 Genomes-Sammlung nach Ökotypen durchsucht, die weniger empfindlich auf dunkelrotes Licht reagieren, was darauf hindeutet, dass in diesen Ökotypen entweder phyA weniger aktiv ist oder dass die nachgeschaltete phyA-Signalleitung im Vergleich zum Referenz-Ökotyp Col-0 weniger effizient ist. Die meisten Ökotypen, die weniger empfindlich auf Dunkelrotlicht reagieren als Col-0, enthalten keine Polymorphismen im PHYA-Gen, die die phyA-Proteinsequenz ändern. Dies deutet darauf hin, dass in diesen Ökotypen möglicherweise die nachgeschaltete phyA-Signalleitung beeinträchtigt ist. Für Ökotypen, bei denen die geringere Dunkelrotlicht-Sensitivität als monogenes Merkmal segregiert, wenn sie in Col-0-Hintergrund gekreuzt werden, planen wir, die für den Phänotyp verantwortlichen Polymorphismen durch einen "educated guess"-Ansatz oder durch Genkartierung zu identifizieren. Insgesamt konnten wir aber auch 21 Ökotypen finden, die Polymorphismen im PHYA-Gen enthalten, die zu Änderungen in der phyA-Proteinsequenz führen, und die weniger empfindlich sind gegenüber Dunkelrotlicht als der Referenz-Ökotyp Col-0. In zukünftigen Arbeiten wollen wir untersuchen, ob und wie sich diese Aminosäuresubstitutionen auf die spektralen und molekularen Eigenschaften von phyA auswirken. Nach dem Zeitplan hätten diese Analysen im Rahmen des Projekts durchgeführt werden sollen. Aufgrund des eingeschränkten Zugangs zum Labor und der verspäteten Lieferung von wichtigen Chemikalien und Kits während der Corona-Pandemie verzögerte sich dieser Teil des Projekts jedoch. Im zweiten Teil des Projekts optimierten wir ein Protokoll für die Expression und Reinigung von unmarkiertem photoaktivem phyA unter Verwendung eines E. coli-Stamms, der das natürliche Chromophor von Phytochromen synthetisieren kann. Wir entwickelten ein Protokoll, das es uns ermöglichte, genügend phyA mit ausreichend hoher Reinheit zu erhalten, um Kristallisationsversuche zu starten. Wir haben Bedingungen ermittelt, unter denen wir beugungsfähige phyA-Proteinkristalle erhalten. Langfristiges Ziel ist es, auf diesem Protokoll aufzubauen und das Verfahren weiter zu verbessern, um Kristallstrukturen verschiedener phyA-Varianten zu erhalten. Dadurch wollen wir verstehen, wie Aminosäuresubstitutionen in phyA dessen Funktion beeinflussen. Das für die Expression und Reinigung von photoaktivem phyA etablierte Protokoll hat auch zu großen Fortschritten in anderen Projekten geführt und zu einer Veröffentlichung beigetragen, die zeigt, dass phyA die Bindung spezifischer Transkriptionsfaktoren an Zielpromotoren reguliert und so die Samenkeimung steuert.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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The phytochrome interacting proteins ERF55 and ERF58 repress light-induced seed germination in Arabidopsis thaliana. Nature Communications, 13(1).
Li, Zenglin; Sheerin, David J.; von Roepenack-Lahaye, Edda; Stahl, Mark & Hiltbrunner, Andreas
