Regulation der DNA – Schadensantwort durch gebündelte Phosphorylierungsstellen im p53 Signalnetzwerk

• Antragsteller: Professor Dr. Alexander Loewer
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Biochemie ; Bioinformatik und Theoretische Biologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 446059690

Der Transkriptionsfaktor p53 koordiniert die zelluläre Antwort auf genotoxischen Stress. Er wird von einem Signalnetzwerk kontrolliert, dass unter anderem die schadensinduzierten Kinasen ATM, ATR und DNA-PK (PIKKs), die Ubiquitin-Ligase Mdm2, die Phosphatase Wip1 und die Kinase Chk2 enthält. Diese Kinasen und Phosphatasen sowie reziproke Rückkopplungsschleifen erzeugen wiederholte pulsförmige p53 Akkumulationen, deren Anzahl und Dauer die Expression von Zielgenen und das Zellschicksal bestimmen. Im gegenwärtigen Model erzeugt i) die konstitutive Expression von p53 und die Rückkopplung über Mdm2 niedrige basale Proteinlevel; ii) aktiveren PIKKs p53 und inhibieren Mdm2 so lange DNA – Schaden vorhanden ist; iii) löst p53 Akkumulation Mdm2 und Wip1 Expression aus; iv) macht Wip1 PIKK-vermittelte Modifikationen rückgängig. Obwohl diese Interaktionen die bisher beobachteten p53 Dynamiken weitgehend erklären können, legen neue biochemische Messungen und Untersuchungen mit pharmakologischen Inhibitoren die Existenz zusätzlicher regulatorischer Mechanismen nahe.Unser Fokus liegt dabei auf bisher unerforschten Phosphorylierungsreaktionen im p53 Netzwerk: i) Proteine beinhalten gebündelte Modifizierungsstellen für PIKKs, Chk2 und Wip1, die die Reaktionskinetiken funktionaler Phosphorylierungsstellen beeinflussen; ii) anhaltende p53 Pulse hängen von Chk2 und nicht von PIKKs ab. Auf Grund dieser Beobachtungen haben wir die Hypothese aufgestellt, dass i) gebündelte Modifizierungsstellen als Puffer dienen, um nach DNA-Schäden Schwellenwerte zu setzen und molekulare Zeitgeber zu implementieren, und ii) p53 Pulse durch ATM als Antwort auf akuten Stress ausgelöst werden, aber Chk2 für die Aufrechterhaltung der p53–Antwort und die entsprechende zelluläre Antwort bei anhaltendem Schaden verantwortlich ist.Zur Überprüfung dieser Hypothesen wollen wir durch eine Kombination biochemischer und zellbiologischer Ansätze untersuchen, wie gebündelte Phosphorylierungsstellen die Kinetik der Schadensantwort beeinflussen. Dabei konzentrieren wir uns auf Phosphorylierungen von Mdm2, Chk2 und Wip1 und deren Einfluss auf die jeweiligen Enzymaktivitäten. Die Modifizierung von p53, Mdm2, Chk2 und Wip1 werden quantitativ und ortsspezifisch mittels NMR gemessen. Durch Strukturanalysen wird deren Einfluss auf Mdm2, Chk2 und Wip1 Inhibition bzw. Destabilisierung untersucht. Die Funktion einzelner Phosphorylierungsstellen in Zellen und das Zusammenspiel von Kinasen und Phosphatasen in der Regulation der Schadensantwort wird mittels Cas9-vermittelter Genomeditierung und zeitaufgelöster Lebendzellmikroskopie bestimmt und anhand mathematischer Modelle untersucht. Durch Integration biochemischer und strukturbiologischer Datensätze mit zeitaufgelösten Messungen der zellulären Signalverarbeitung in einem systembiologischen Ansatz werden wir ein besseres Verständnis der p53-vermittelten Schadensantwort erlangen und neue Ansätze zu deren Manipulation im Kontext der Krebstherapie ermöglichen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Frankreich
• Partnerorganisation: Agence Nationale de la Recherche / The French National Research Agency
• Kooperationspartner: Dr. Francois-Xavier Theillet