Systematische Aufklärung der Kooperationsmechanismus von Transkriptionsfaktoren

• Antragsteller: Dr. Arnaud Krebs, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 446603164

Die präzise Ausführung von Transkriptionsprogrammen ist Voraussetzung für die korrekte Übernahme der Zellidentität während der Entwicklung. Diese Identität wird durch Genexpressionsmuster definiert, welche weitgehend durch Transkriptionsfaktoren (TFs) reguliert werden. TFs binden an Sequenzmotive, die in cis-regulierenden Elementen (CREs) enthalten sind, was zur Rekrutierung von Kofaktoren und letztendlich zur Aktivitätsregulierung der Zielgene führt. CREs werden typischerweise von mehreren TFs gebunden, die gemeinsam an der Remodellierung des Chromatins mitwirken und ihre Aktivität definieren. Daher wird angenommen, dass die Kooperation innerhalb der TFs essentiell für die Transkriptionsregulierung ist. Zur Erklärung dieses Phänomens wurden mehrere komplementäre Mechanismen vorgeschlagen, jedoch ist die genaue Rolle der Kooperation bei der Kontrolle der Aktivität von CREs weitgehend unbekannt. Die Erforschung des Einflusses der TF-Kooperation auf die Genexpression erfordert ein System, das die Bindung einzelner TFs selektiv stört und die Folgen für die kollektive TF-Bindung sowie die transkriptionelle Aktivität von CREs quantifiziert. Moderne Ansätze zur Analyse der TF-Bindung basieren auf der selektiven Anreicherung der durch einzelne TFs gebundenen DNA und geben keine Auskunft über das Ausmaß der Kooperation zwischen TFs. Deshalb schlagen wir hier vor, die Grenze mit Single Molecule Footprinting (SMF) zu überschreiten. Dies ist eine Methode, mit der wir kürzlich die Bindung mehrerer TFs an CREs gleichzeitig quantifizieren konnten. Wir werden die natürliche genetische Variation zwischen entfernten Mausarten nutzen, um die Wirkung von Affinitätsänderungen von TF-Bindungsstellen im gesamten Genom zu untersuchen. Wir werden kollektive TF-Bindungsmuster mithilfe von SMF in vier verschiedenen Genotypen quantifizieren, die sich durch eine hohe Anzahl von einzelnen Nukleotidvarianten unterscheiden. Mit den gewonnenen Daten können wir die Auswirkungen der genetischen Veränderungen von Tausenden einzelner Bindungsstellen auf die kollektive TF-Bindung in CREs analysieren. Darüber hinaus werden wir die Folgen dieser Veränderungen für die Aktivität von CREs in embryonalen Stammzellen der Maus und während ihrer Differenzierung zu Neuronen untersuchen. Dieser Pertubationsversuch wird es uns ermöglichen, die Mechanismen, die der TF-Kooperation an CREs zugrunde liegen, genomweit zu identifizieren und ihren Einfluss auf die Wahl des Zellschicksals zu modellieren. Außerdem werden wir die Vorhersagen unseres Modells weiter testen, indem wir die TF-Bindung und Transkriptionsaktivität von Tausenden synthetischen CRE-Varianten mit zuvor entworfenen Mutationen messen. Zusammengefasst wird das vorgeschlagene Projekt die TF-Kooperationsmechanismen charakterisieren und ihren Einfluss auf die transkriptionelle Regulierung während der zellulären Differenzierung deutlich machen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen