Entschlüsselung des Mechanismus der Nukleotidselektion, -addition und des Proofreadings des SARS- Coronavirus Replikations-Transkriptionskomplexes auf Single Molecule Ebene

• Antragsteller: Dr. David Dulin, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Virologie ; Biophysik
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 447835095

RNA Viren sind eine sehr facettenreiche Gruppe der Pathogene. Dies ist besonders zu erkennen an der großen Vielfalt an Faktoren, die an ihrem Replikatios-Transkriptionskomplex (RTC) beteiligt sind, ebenso wie an ihrem Einfallsreichtum im Bereich der messenger und genomischer RNA Synthese. Die Synthese viraler RNA wird durch den RTC sichergestellt, der, durch den Einbau von Nukleotid mismatches und durch das Fördern von viraler Genrekombination, die virale Evolution sicherstellt. Die Mutationsrate des RTC ist jedoch zu groß, als das RNA Viren mit langem positivem Einzelstrang als Genom, wie zum Beispiel Coronaviren (CoV) (30kb) noch infektiöse Virionen herstellen könnten. CoV haben dieses Problem gelöst, indem sie für ein RNA proofreading Enzym, hier eine 3’-5’ Exonuclease, kodiert, mit deren Hilfe die exzessive Anzahl an Mutationen korrigiert wird. Dies schützt auch humane pathogene CoV, wie die Verursacher des Middle East respiratory syndrome (MERS), des severe acute respiratory syndrome (SARS) und das neue CoV 2019 (SARS-CoV-2) vor Nukleotidanalogen, die gezielt den RTC beeinflussen sollen. Um effektivere antivirale Wirkstoffe zu entwickeln ist es daher sehr wichtig zu verstehen, wie die CoV Exonuclease Nukleotid mismatches und Nukleotidanaloge nach deren Einbau erkennt. Die standard bulk Biochemie Methoden verwenden kurze templates (10 nt) und keine konkurrierenden Nukleotide um die Kinetik von Nukleotid mismatch und des Einbaus von Analogen zu charakterisieren. Dies enspricht jedoch nicht den reellen Bedingungen. Durch Nutzung von high-throughput Magnetic Tweezers werde ich die kinetische Signatur des Inkorporation von Nukleotid mismatches und von Nukleotidanalogen durch den SARS-CoV RTC auf Single Molecule Ebene mit einer nahezu single base resolution unter der Verwendung von kilobasen langen templates und den vier natürlichen, in saturierter Konzentration konkurrierenden Nukleotiden untersuchen können. Der SARS-CoV RTC ist der wohl am Besten verstandene Coronavirus RTC, und dank des hohen Grads an Konservierung der CoV RTC werden die Resultate dieses proposals auch auf andere CoVs, wie MERS und SARS-CoV-2 übertragbar sein. Ich werde anhand des SARS-CoV RTC ein vollständiges kinetisches Modell ableiten, dass die Kinetik der Nukleotid mismatch Inkorporation und den Wirkungsmechanismus kommerziell erhältlicher Nukleotidanaloge beschreibt.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Frankreich, Niederlande
• Kooperationspartner: Privatdozent Dr. Bruno Canard