Rolle und Redoxregulation des Integrins α2β1 in Osteoklasten bei Differenzierung und Osteolyse

• Antragsteller: Professor Dr. Johannes Andreas Eble
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 448288075

Aus monozytären Blutstammzellen differenzierte Osteoklasten (OCs) sind essentiell für Knochenerhalt und –umbau. Spezifische Zytokine fördern Synzytienbildung und Adhäsion von OCs an die ossäre extrazelluläre Matrix (EZM) sowie die Bildung extrazellulärer Lysosomen-ähnlicher Lakunen. Diese sind durch eine α2β1 und αVβ3 Integrin-reiche Versiegelungszone, in der OCs fest an die EZM adhärieren, abgedichtet. Differenzierungsabhängig produzieren OCs reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Diese können Integrine über Thiolschalter aus Cysteinpaaren, vermutlich in der Gelenkregion, redox-regulieren. Trotz hohen Kollagengehalts der Knochen-EZM sind die Rolle des α2β1 Integrins in OCs, im Gegensatz zu αVβ3, und seine redoxregulierten Effekte noch unklar.Unsere Ziele sind daher (1) redoxregulierte Thiolschalter in α2β1 Integrin zu identifizieren; (2) die kollagenabhängige α2β1- und OSCAR-vermittelte OC-Differenzierung und Osteolyse zu charakterisieren; (3) die Bildung von ROS durch OCs und die α2β1-vermittelte Redoxregulation ihrer Differenzierung und der Osteolyse zu analysieren; und (4) die durch ROS reguliertes Integrin α2β1 und OSCAR vermittelten Signalvorgänge aufzuklären.Zur Charakterisierung der Thiolschalter in α2β1 Integrin-Ektodomänen werden redoxsensitive Cysteine identifiziert und zu redoxinaktiven Resten mutiert und anschließend gegenüber dem Wildtyp auf molekularer Ebene proteinchemisch (Bindungs- und Konformations-Tests, Kraftmessungen) charakterisiert. Zur in vitro-Charakterisierung von α2β1 wird Integrin αV in aus ER-HoxB8-Zellen differenzierten OCs ausgeschaltet oder gehemmt. Außerdem wird das murine ITGA2-Gen durch homologe humane cDNAs ersetzt, die für Wildtyp bzw. Cysteinmutanten codieren. Die OC-Differenzierung aufgrund ihrer α2β1-vermittelten Adhäsion an Kollagen und integrinspezifischer Mini-Kollagene wird mittels qRT-PCR und Durchflusszytometrie überprüft. Die Osteolyse wird fluoreszenzmikroskopisch (Lokalisierung von Integrinen und Aktinzytoskelett in der Versiegelungszone) und durch funktionelle Tests der Lakune (fluoreszenzmikroskopischer Nachweis der Ansäuerung, Hydroxylapatit-Resorption, Kollagenolytische Enzyme und Produkte) gemessen. Mit rezeptorspezifischen Antikörpern, Mini-Kollagenen und Toxinen wird selektiv die Rolle von α2β1- bzw. OSCAR-vermitteltem Zell-Kollagen-Kontakt geprüft. Zusätzlich zur Quantifizierung der ROS-Produktion durch OCs werden Differenzierung und Osteolyse von OCs mit redoxregulierbarem bzw. cysteinmutiertem α2β1 Integrin nach Wasserstoffperoxidgabe gemessen, um Effekte der Redoxregulation von α2β1 Integrin in OCs aufzuzeigen. Durch Kollagen ausgelöste Signalwege über α2β1 und OSCAR werden anhand der Phosphorylierungsmuster von Signalübertragungsproteinen in OCs analysiert.Die Rolle von α2β1 Integrin und seine redoxregulatorischer Wirkung auf OC-Differenzierung und Osteolyse aufzuklären, hilft die molekularen und zellulären Prozesse bei osteolytischen Knochenerkrankungen wie der Osteoporose zu verstehen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen