Sense and switch across scales – genetisch kodierte, reversible schaltbaren Indikatoren für Calciumionen; Nutzbar in der Hochauflösende Mikroskopie sowie in der Optoakustische Bildgebung

• Antragsteller: Andre Stiel, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 448529311

Calciumionen (Ca2+) sind an der Signalübertragung der meisten Zelltypen, speziell im Gehirn, entscheidend beteiligt, sodass bildgebende Untersuchungen zur Ca2+-Verteilung von großer Relevanz sind. Aber erst die Entwicklung genetisch kodierbarer Ca2+-Indikatoren (GECI) ermöglichten longitudinale Tierstudien zur Erforschung neuronaler Dynamiken in vivo. Während solche Indikatoren eine gute zeitliche Auflösung bieten, ist die räumliche Auflösung durch die Grenzen der optischen Auflösung herkömmlicher Fluoreszenzmikroskope limitiert. Ebenso ist das Sichtfeld in der Mikroskopie häufig begrenzt, sodass es schwierig ist, die Ca2+ Dynamik z.B. in ganzen Nager-Gehirnen in vivo zu beobachten. Es besteht also an beiden Enden der Skala das Bedürfnis nach entsprechenden Bildgebungsfahrfahren und speziell darauf zugeschnittenen Ca2+ Indikatoren. Auf technischer Seite konnten zwei Entwicklungen diese Limitationen überwinden: Zum einen wurde die Auflösungsgrenze durch die Einführung von Hochauflösungs (SR)-Fluoreszenzmikroskopie überwunden. Zum anderen wurde die Tiefenbegrenzung optischer Methoden durch die Entwicklung der Optoakustik (OA) umgangen, welche hochauflösende Echtzeit-in-vivo-Bildgebung bis in Tiefen von über 1 cm durch Kombination von optischem Kontrast und Ultraschalldetektion erlaubt. Photoschaltbare Farbstoffe, so genannte reversibel schaltbare Proteine, waren für beide Techniken entscheidend: In der SR können die nötigen reversiblen Übergänge zwischen zwei Zuständen durch Photoschalten zwischen fluoreszierendem und nicht-fluoreszierendem Zustand erreicht werden. Während für die OA das gleiche Photoschalten die Modulation des Signals und eine dadurch mögliche anschließende Trennung des Signals vom Hintergrund erlaubt. Dies ergibt eine entscheidende Verbesserung des Kontrast-Rauschen-Verhältnisses (CNR) und ermöglicht somit die Detektion auch niedrigen Zellzahlen in lebenden Tieren.Dementsprechend schlagen wir vor, diese revolutionären Vorteile der Photoschalter für beide Modalitäten, zu nutzen und transgene Ca2+-Indikatoren auf der Basis von Photoschaltern zu entwickeln (rsGECI). Diese erlauben es, Ca2+-Verteilungen mit beispielloser räumlicher Auflösung zu untersuchen und das CNR in der OA auf ein Niveau zu erhöhen, welches die Ca2+-Bildgebung in ganzen Tieren in vivo ermöglicht. Basierend auf blau absorbierenden Photoschaltern für SR und nah-infraroten für OA, ist es das Ziel des Projektes rsGECIs zu entwickeln, welches den Einsatz von Photoschalten in der transgenen Ca2+-Bildgebung demonstriert und Grundlage für weitere Entwicklungen ist. RsGECIs werden die Erforschung vieler Prozessen, die durch Ca2+-Gradienten reguliert werden, erheblich erleichtern, z.B. Zellkommunikation, Metabolismus oder Entwicklungsvorgänge. Darüber hinaus wird diese Arbeit ein Konzept für die Entwicklung schaltbarer Indikatoren für andere Ionen oder Botenstoffe liefern und somit Funktionsstudien vom Nanobereich bis zu ganzen Tieren ermöglichen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen