Visualisierung von Zell-Material-Wechselwirkungen mittels Coiled-Coil-basierter molekularer Kraftsensoren

• Antragstellerin: Professorin Dr. Kerstin Blank
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Biochemie ; Statistische Physik, Nichtlineare Dynamik, Komplexe Systeme, Weiche und fluide Materie, Biologische Physik
• Förderung: Förderung von 2021 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 449551016

• Erstellungsjahr: 2024

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Bei der Regulierung gesunder und pathologischer Zellfunktionen spielen mechanische Signale eine wichtige Rolle. Diese Signale werden über Fokalkontakte (FK) von der intrazellulären in die extrazelluläre Umgebung und umgekehrt übertragen. Die Entschlüsselung der zugrundeliegenden Mechanismen ist entscheidend für das Verständnis der Zellfunktion und die Diagnose und Behandlung von Krankheiten. Ziel dieses Projekts war die Entwicklung einer neuen Generation molekularer Kraftsensoren (MKS) zur Visualisierung und Quantifizierung molekularer Kräfte zwischen FK-Rezeptoren und ihren extrazellulären Liganden. Diese MKS wandeln Zellkräfte in fluoreszierende Signale um, die mit optischer Mikroskopie ausgelesen werden können, wie sie üblicherweise zur Beobachtung zellulärer Strukturen verwendet wird. Nach dem Vorbild extrazellulärer Matrixproteine bestehen diese MKS aus mechanisch kalibrierten Coiled Coils (CCs) und werden mit einem Liganden und einem fluoreszierenden Reportersystem auf der Grundlage von Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ausgestattet. Ein wesentliches Merkmal der MKS ist, dass sie eine ähnliche Thermodynamik und Kinetik aufweisen, während ihre mechanische Stabilität über einen Bereich an Zuggeschwindigkeiten variiert. Dies wird erreicht, indem verschiedene Kraftangriffspunkte für ein und dasselbe CC realisiert werden. Um CCs als MKS zu etablieren, wurden diese zunächst mit Einzelmolekülkraftspektroskopie kalibriert. Anschließend wurden (1) ein Donor-Akzeptor-Paar eingeführt, mit dem ein intakter MKS (FRET) von der dissoziierten Struktur (kein FRET) unterschieden werden kann, und (2) das CC mit einem Liganden ausgestattet. Ein Vergleich organischer Fluorophore mit fluoreszierenden Proteinen zeigt, dass die FRET-Effizienz über den strukturellen Zustand des CCs Auskunft gibt. Allerdings muss die experimentelle Strategie optimiert werden, weshalb noch keine Zellkulturexperimente mit FRET-markierten CCs durchgeführt werden konnten. Zellexperimente wurden bisher mit unmarkierten MKS durchgeführt, die Integrin-bindende RGDS-Liganden besitzen. Fibroblasten wurden auf RGDS-MKS-funktionalisierten Oberflächen ausgesät, 30 bis 120 Minuten lang gezüchtet, fixiert und immungefärbt, um den Zellkern, Aktinfilamente und FKs (p-Paxillin) zu visualisieren. Es wurden deutliche Unterschiede zwischen Zellen beobachtet, die auf RGDS-MKS- funktionalisierten Oberflächen und Kontrolloberflächen mit kovalent gekoppeltem RGDS ausgesät wurden. Die Ergebnisse deuten an, dass die getesteten MKS mechanisch zu instabil sind, um den Zellkräften zu widerstehen, so dass eine langfristige Zellanhaftung unmöglich ist. Zukünftige Arbeiten konzentrieren sich auf die Entwicklung stärkerer MFS, die Optimierung des FRET-Reportersystems und die Mikroskopie von lebenden Zellen, um MKS in Echtzeit zu beobachten. Wir gehen davon aus, dass diese MKS-Plattform die Analyse von Zellen mit veränderten mechanischen Profilen, wie sie bei Krankheiten auftreten können, unterstützen kann.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• Shedding Light on Cell-Material Interactions with Coiled Coil-based Molecular Force Sensors (Dec 2021) Lorentz Workshop on Cancer in a Physical Context: from Understanding to Therapeutics, online (invited lecture, Kerstin Blank)
  Kerstin Blank
  
• 2D Mechanoresponsive Surfaces for Measuring Cellular Traction Forces (Sept 2022) German Biophysical Society Meeting 2022, Konstanz/Germany (poster, Russell Wilson)
  Russell Wilson
  
• Coiled Coil Molecular Force Sensors for Measuring Cellular Force & Attachment (Sept 2022) Alpbach Workshop Coiled-Coil, Fibrous & Repeat Proteins, Alpbach/Austria (contributed talk, Russell Wilson)
  Russell Wilson
  
• Shedding Light on Cell-Material Interactions with Coiled Coil-based Molecular Force Sensors (March 2022) Nanoengineering for Mechanobiology (N4M), Camogli/Italy (invited lecture, Kerstin Blank)
  Kerstin Blank
  
• Coiled Coils as Molecular Force Sensors - from molecular mechanisms towards applications in cell biology (Aug 2023) 11th International Conference on Biological Physics, Seoul/Korea (invited lecture, Kerstin Blank)
  Kerstin Blank
  
• Coiled coils as molecular force sensors: from molecular mechanisms and design to biological applications (Dec 2023) 12th Austrian Peptide Symposium, Vienna/Austria (contributed talk, Russell Wilson)
  Russell Wilson
  
• Kleine Kräfte, große Wirkung: mechanische Prozesse in unserem Körper (May 2023) MINT TANK Summer School, Linz/Austria (Kerstin Blank)
  Kerstin Blank
  
• Coiled coils as mechanoresponsive sensors for measuring cell forces and attachment (July 2024) Gordon Research Conference on Multiscale Mechanochemistry and Mechanobiology, Lewiston (ME)/USA (poster, Russell Wilson)
  Russell Wilson
  
• Coiled coils as mechanoresponsive sensors for measuring cell forces and attachment (July 2024) Gordon Research Seminar on Multiscale Mechanochemistry and Mechanobiology, Lewiston (ME)/USA (contributed talk, Russell Wilson)
  Russell Wilson
  
• Coiled Coils as Molecular Force Sensors (Feb 2024) XXIII. Annual Linz Winter Workshop, Linz/Austria (contributed talk, Kerstin Blank)
  Kerstin Blank
  
• Coiled Coils as Molecular Force Sensors: from Molecular Mechanisms to Applications in Cell Biology (July 2024) Biophysics Austria Conference 2024: Advancing Science, Salzburg/Austria (contributed talk, Kerstin Blank)
  Kerstin Blank
  
• Kleine Kräfte, große Wirkung: mechanische Prozesse in unserem Körper (Feb 2024) Rotary Club Linz, Linz/Austria (Kerstin Blank)
  Kerstin Blank
  
• Kleine Kräfte, große Wirkung: mechanische Prozesse in unserem Körper (Feb 2024) Traumberuf Technik, Linz/Austria (Kerstin Blank)
  Kerstin Blank
  
• Structure-Mechanics Relationships of Heterodimeric Coiled Coils (March 2024) Spring Meeting of the German Physical Society, Berlin/Germany (contributed talk, Kerstin Blank)
  Kerstin Blank
  
• Structure-Mechanics Relationships of Heterodimeric Coiled Coils (Sept 2024) 73rd Annual Meeting of the Austrian Physical Society, Linz/Austria (contributed talk, Kerstin Blank)
  Kerstin Blank
  
• What do Bubble Tea and Tissue Regeneration have in Common? (May 2024) Long Night of Research 2024, Linz/Austria (Russell Wilson)
  Russell Wilson