Vitamin B6-Stoffwechsel in dem Gram-positiven Modellbakterium Bacillus subtilis
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Pyridoxal (PL) und Pyridoxal-5’-Phosphat (PLP) gehören zu den “Vitamin B6”-Vitameren. PLP ist ein Cofaktor für Enzyme und moduliert die Aktivität von Transkriptionsfaktoren. Vitamin B6 spielt auch eine Rolle bei der Anpassung an oxidativen Stress und erfüllt somit lebenswichtige Funktionen. Zwei Wege für die PLP-Biosynthese sind bekannt: Der Deoxy-Xylulose-Phosphat (DXP)-abhängige und der DXP-unabhängige Weg. Im letzteren Weg bildet der PdxST-Komplex, welcher aus der Glutaminase PdxT und der PLP-Synthase PdxS besteht, das PLP. Bisher wurden wenige Vitamin B6-Transporter beschrieben. Das Gram-positive Modellbakterium Bacillus subtilis synthetisiert PLP über den PdxST-Komplex. B. subtilis muss auch über ein unbekanntes PL-Aufnahmesystem verfügen. Außerdem ergab eine Untersuchung, dass B. subtilis mindestens 65 PLP-abhängige Proteine besitzt, von denen ein Drittel wenig charakterisiert wurde. Die am Vitamin B6-Stoffwechsel beteiligten Proteine müssen selbst bei gut untersuchte Modellbakterien noch untersucht werden. Die Transporter für die Aufnahme von PL sind ebenfalls unbekannt. Außerdem bleibt zu klären, wie das reaktive PLP an die Zielproteine gelangt. Kürzlich wurde gezeigt, dass evolvierte B. subtilis pdxST- Mutanten, die einen verkürzten heterologen DXP-abhängigen Vitamin B6-Biosyntheseweg nutzen, durch wenige Mutationen eine Blockade in der PLP-Synthese umgehen. Ziel des Vorhabens war die Identifizierung des PL-Aufnahmesystems. In B. subtilis konnte jedoch kein Transportsystem identifiziert werden. Eine Suppressoranalyse ergab, dass PL hochtoxisch ist und dass Mutationen die PL-Toxizität verringern können. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse der Suppressoranalyse und die Charakterisierung von Transporter-Mutanten darauf hin, dass B. subtilis kein PL- Aufnahmesystem besitzt. Ziel war auch die Identifizierung von PdxT-unabhängigen PdxS-Varianten. Ein Suppressor-Screening ergab, dass die Ammonium-Limitation aufgrund der Abwesenheit von PdxT durch Mutationen, die entweder die Ammonium-Assimilation oder die pdxS-Gendosis erhöhen, aufgehoben wird. Dies legt nahe, dass der katalytische Mechanismus von PdxS die Evolution der PLP-Synthase einschränkt. Aufgrund seiner Reaktivität wird das am PdxST-Komplex gebildete PLP wahrscheinlich direkt auf die PLP-abhängigen Proteine übertragen. In vivo-Crosslinking- und Proteinreinigungs-Experimente ergaben jedoch, dass in B. subtilis wahrscheinlich kein PdxST- Interaktom existiert. Schließlich wurde bestätigt, dass das native YtoQ-Protein unbekannter Funktion an der PLP-Synthese in den B. subtilis pdxST-Suppressoren mitwirkt. Die Strukturbestimmung von YtoQ ergab, dass das Protein als Nukleosid-2-Deoxyriboysltransferase agieren könnte. Zusammenfassend zeigt das Projekt, dass PLP in winzigen Mengen benötigt wird und dass das B6- Vitamer über unspezifische Transporter aufgenommen wird. Dies könnte erklären, warum in der Vergangenheit nur wenige PL-Aufnahmesysteme identifiziert wurden. Die Erkenntnis, dass die Überexpression von pdxS ausreicht, um den zellulären Bedarf an PLP zu decken, ist wichtig, wenn es um die Konstruktion Genom-reduzierter Bakterien geht. Schließlich dient die weitere Charakterisierung der B. subtilis-Mutanten, die PLP über einen verkürzten DXP-abhängigen Weg herstellen, dem Verständnis, wie ein nicht-nativer Weg in ein bestehendes metabolisches Netzwerk implementiert wird.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Complete Genome Sequence of the Prototrophic Bacillus subtilis subsp. subtilis Strain SP1. Microbiology Resource Announcements, 9(32).
Richts, Björn; Hertel, Robert; Potot, Sébastien; Poehlein, Anja; Daniel, Rolf; Schyns, Ghislain; Prágai, Zoltán & Commichau, Fabian M.
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A Bacillus subtilis Δ pdxT mutant suppresses vitamin B6 limitation by acquiring mutations enhancing pdxS gene dosage and ammonium assimilation. Environmental Microbiology Reports, 13(2), 218-233.
Richts, Björn; Lentes, Sabine; Poehlein, Anja; Daniel, Rolf & Commichau, Fabian M.
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The Bacillus subtilis Minimal Genome Compendium. ACS Synthetic Biology, 10(10), 2767-2771.
Michalik, Stephan; Reder, Alexander; Richts, Björn; Faßhauer, Patrick; Mäder, Ulrike; Pedreira, Tiago; Poehlein, Anja; van Heel, Auke J.; van Tilburg, Amanda Y.; Altenbuchner, Josef; Klewing, Anika; Reuß, Daniel R.; Daniel, Rolf; Commichau, Fabian M.; Kuipers, Oscar P.; Hamoen, Leendert W.; Völker, Uwe & Stülke, Jörg
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Underground metabolism facilitates the evolution of novel pathways for vitamin B6 biosynthesis. Applied Microbiology and Biotechnology, 105(6), 2297-2305.
Richts, Björn & Commichau, Fabian M.
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The low mutational flexibility of the EPSP synthase in Bacillus subtilis is due to a higher demand for shikimate pathway intermediates. Environmental Microbiology, 25(12), 3604-3622.
Schwedt, Inge; Schöne, Kerstin; Eckert, Maike; Pizzinato, Manon; Winkler, Laura; Knotkova, Barbora; Richts, Björn; Hau, Jann‐Louis; Steuber, Julia; Mireles, Raul; Noda‐Garcia, Lianet; Fritz, Günter; Mittelstädt, Carolin; Hertel, Robert & Commichau, Fabian M.
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Biodegradation of selected aminophosphonates by the bacterial isolate Ochrobactrum sp. BTU1. Microbiological Research, 280, 127600.
Riedel, Ramona; Commichau, Fabian M.; Benndorf, Dirk; Hertel, Robert; Holzer, Katharina; Hoelzle, Ludwig E.; Mardoukhi, Mohammad Saba Yousef; Noack, Laura Emelie & Martienssen, Marion
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Control of asparagine homeostasis in Bacillus subtilis : identification of promiscuous amino acid importers and exporters. Journal of Bacteriology, 206(2).
Meißner, Janek; Königshof, Manuel; Wrede, Katrin; Warneke, Robert; Mardoukhi, Mohammad Saba Yousef; Commichau, Fabian M. & Stülke, Jörg
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Metabolic rewiring enables ammonium assimilation via a non‐canonical fumarate‐based pathway. Microbial Biotechnology, 17(3).
Mardoukhi, Mohammad Saba Yousef; Rapp, Johanna; Irisarri, Iker; Gunka, Katrin; Link, Hannes; Marienhagen, Jan; de Vries, Jan; Stülke, Jörg & Commichau, Fabian M.
