Mechanismen der Assemblierung und Umstrukturierung von Intraflagellarer Transport Maschinerie

• Antragstellerin: Dr. Zeynep Ökten
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 449713185

Zilien befinden sich nahezu auf jeder menschlichen Zelle. Zum Aufbau solcher Zilien benötigt die Zelle den evolutionär hoch konservierten Intra-Flagellar-Transport (IFT) und Fehler beim diesem Aufbau manifestiert sich in schwerwiegenden Krankheiten, den sog. Ziliopathien. Die regulatorischen Mechanismen des IFT Prozesses sind allerdings weitgehend unbekannt. Wie werden Multi-Megadalton große, sogenannte IFT-Züge aus mehr als 20 verschieden kleinen Protein Untereinheiten assembliert? Wie werden die IFT-Züge umgebaut, um entweder Kinesin-2 oder Dynein-2-abhängigen Transport zu ermöglichen? Es hat sich mittlerweile herausgestellt, dass das Vorhandensein der verschiedenen IFT Untereinheiten per se nicht ausreicht, um solche protein-basierte Komplexe zu formen. Welche regulatorischen Mechanismen kommen für die Assemblierung und den Umbau der IFT-Züge in Frage? Über die letzten Jahre wurden mehrere zilienlokalisierten Kinasen in verschiedenen Modelorganismen entdeckt, deren molekularen Rollen weitgehend unklar sind. In einem mechanistischen in vitro Ansatz haben wir entdeckt, dass spezifische, rekombinant exprimierte IFT Protein Untereinheiten von zilienlokalisierten Kinasen phosphoryliert werden. Erstaunlicherweise fördert Phosphorylierung die Oligomerisierung einzelner Untereinheiten. Phosphorylierung anderer Untereinheiten jedoch lässt Oligomere zu Monomeren zerfallen. Mutagenese bestätigt unsere vorläufigen Schlussfolgerungen in vitro sowie in C. elegans Modellsystem in vivo. Unsere Ergebnisse implizieren, dass reversible Phosphorylierung einen wichtigen Einfluss auf den Zusammenbau oder Zerfall der IFT-Züge ausübt. Im Rahmen dieses Projektes untersuchen wir daher den Einfluss von zilienlokalisierten Kinasen auf die Struktureigenschaften einzelner IFT Untereinheiten sowie innerhalb ihrer jeweiligen Komplexe in vitro und in vivo. Eins unserer Hauptziele ist ein Phosphorylierungs-reguliertes Interaktom der IFT Untereinheiten zu erstellen. Dafür verwenden wir SEC-MALS Analyse, Mutagenese, sowie quantitative Phospho-Massenspektrometrie. Des Weiteren werden wir die 3-D Strukturen der Oligomere durch Crosslinking und Strukturmodellierung bestimmen. Wie anhand der ersten Untereinheit demonstriert, werden unsere vitro Analysen uns erlauben, definierte in vivo Experimente zu planen, um den Einfluss der Phosphorylierungs-abhängigen Prozesse mit Aminosäureauflösung aufzuklären. Damit eröffnen wir funktionelle Aspekte, die durch vorhandene ‚steady-state‘ Interaktionskarten von Proteinen im Zilium bislang nicht ersichtlich sind. Mutationen in einigen der reversibel phosphorylierten IFT Untereinheiten führen zu in Ziliopathien. Unser Vorhaben hat daher auch das Potenzial, dem molekularen Verständnis der ziliären Krankheitsbilder beizutragen und ggfs. mögliche Wege zu einer Behandlung aufzuzeigen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen