Design, Synthese und Analyse von photospaltbaren chemischen Crosslinkern zur Entwicklung von verbesserten Methoden in der Crosslinking Massenspektrometrie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Dieses Forschungsprojekt entwickelte neue chemische Werkzeuge und Arbeitsabläufe, um die Struktur von Proteinen und deren Wechselwirkungen zu untersuchen. Die zugrunde liegende Methode ist als Crosslinking-Massenspektrometrie (Crosslinking-MS) bekannt. Dabei werden Proteine mithilfe chemischer Reagenzien miteinander verlinkt, sodass ihre Interaktionen „eingefroren“ werden können. Anschließend werden die verknüpften Bereiche durch Massenspektrometrie analysiert und identifiziert. Eine zentrale Herausforderung in diesem Bereich ist die Identifizierung von verlinkten Peptidpaaren – insbesondere dann, wenn die verwendeten chemischen Verlinkungsreagenzien (Crosslinker) unter denselben Bedingungen dissoziieren wie die Peptide selbst. Um dieses Problem zu lösen, wurde in diesem Projekt eine neue Klasse von UV-spaltbaren Crosslinkern (UCCLs) entwickelt. Diese lassen sich gezielt durch ultraviolettes Licht spalten, ohne Peptidfragmente zu generieren. Dadurch entsteht ein deutlich klareres Spektrum, in dem die separeirten Peptide dann einzeln zur weiteren Fragmentierung ausgewählt werden können, was dann die Zuordnung der Peptidfragmente und damit die Identifikation der Peptide erheblich erleichtert. Darüber hinaus wurden neue computergestützte Algorithmen entwickelt, die diese lichtgesteuerte Spaltung in automatisierte Datenaufnahme-Workflows integrieren. Das Ergebnis ist ein schlanker und allgemein zugänglicher Arbeitsablauf, der erfolgreich an komplexen Proteingemischen aus E. coli-Zellen getestet wurde. Besonders wichtig ist, dass alle Experimente auf handelsüblichen Massenspektrometern durchgeführt wurden, sodass andere Labore diese Methode ohne spezielle Geräteanpassungen übernehmen können. Die neuen Crosslinker und Methoden wurden in Fachzeitschriften mit Peer-Review veröffentlicht und beeinflussen bereits die Entwicklung von Geräten und Software bei kommerziellen Anbietern. Dies zeigt nicht nur die wissenschaftliche Relevanz der Arbeit, sondern auch ihr Potenzial für zukünftige Anwendungen in der Biotechnologie und Strukturbiologie. Das Verständnis von Proteinstrukturen und -interaktionen ist grundlegend, um zu erkennen, wie Zellen funktionieren, wie Krankheiten entstehen und wie neue Therapien entwickelt werden können. Die Crosslinking-MS gehört zu den wenigen Methoden, die strukturelle Informationen direkt aus komplexen biologischen Proben liefern können. Diese Arbeit trägt somit zur übergeordneten Zielsetzung bei, Proteinstrukturen und ihre Netzwerke im großen Maßstab zu kartieren und schafft eine wichtige Grundlage für weitere Forschung und medizinische Anwendungen. Zukünftige Arbeiten konzentrieren sich auf den Einsatz fotoaktivierbarer, heterobifunktioneller Crosslinker, die für großangelegte Studien eine noch höhere Spezifität und Anwendbarkeit versprechen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Cleavable Cross-Linkers Redefined by a Novel MS3-Trigger Algorithm. Analytical Chemistry, 95(42), 15461-15464.
Kolbowski, Lars; Fischer, Lutz & Rappsilber, Juri
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Light-Induced Orthogonal Fragmentation of Crosslinked Peptides. JACS Au, 3(8), 2123-2130.
Kolbowski, Lars; Belsom, Adam; Pérez-López, Ana M.; Ly, Tony & Rappsilber, Juri
