Charakterisierung von Metabolit-Transportern der Organellen, die im Nukleotidstoffwechsel eine Rolle spielen

• Antragsteller: Professor Dr. Claus-Peter Witte
• Fachliche Zuordnung: Biochemie und Biophysik der Pflanzen ; Pflanzenphysiologie
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 452173586

Reaktionen des Nukleotidstoffwechsels finden in allen Organellen der Zelle statt, und Stoffwechselwege des Nukleotidmetabolismus können auf verschiedene Organellen verteilt sein. Einige Transporter, die Metabolite des Nukleotidstoffwechsels über intrazelluläre Membranen transportieren, wurden beschrieben, aber viele Transportvorgänge sind im molekularen Detail noch unverstanden.Dieses Projekt soll den plastidären Transporter für Inosin-Monophosphat (IMP) - ein Endprodukt der Purin-Biosynthese - und den plastidären Transporter für Ribose - ein Produkt des Abbaus der Nukleotide - identifizieren und charakterisieren, sowohl in Phaseolus vulgaris als auch in Arabidopsis thaliana. Um mögliche Transporter mit diesen Funktionen zu identifizieren wurde eine vergleichende Analyse der Knöllchen- und Wurzeltranskriptome von vier Leguminosenarten durchgeführt. Dabei wurden zwei Leguminosen, die fixierten Stickstoff in Form von Amiden aus den Knöllchen exportieren, und zwei Leguminosen, die fixierten Stickstoff in Form von Ureiden exportieren, verglichen. Spezifisch in Knöllchen von Ureidproduzenten sind wahrscheinlich Gene aktiv, deren Produkte in der Purin- und Ureid-Biosynthese benötigt werden. Diese Vermutung wurde anhand vieler bekannter Gene, die in diesen Prozessen involviert sind, bestätigt. In diesem Datensatz wurden Gene für mögliche IMP-Transporter (IMPEX) und einen möglichen Ribosetransporter (RITAP) für P. vulgaris gefunden. Auch wurden dazu homologe Gene in A. thaliana identifiziert.Weitere Untersuchungen erfolgten zunächst mit genetischen Varianten in Arabidopsis und zeigten, dass in einer IMPEX-Mutante die Konzentrationen von Nukleotiden dereguliert sind, wovon insbesondere auch IMP betroffen ist. Zwei unabhängige RITAP-Mutanten in Arabidopsis akkumulierten Ribose, was durch eine externe Gabe von Uridin, welches im Cytosol zu Uracil und Ribose abgebaut wird, spezifisch in den Mutanten noch deutlich verstärkt werden konnte. In diesem Projekt sollen diese Transporter durch Metabolit-Studien an genetischen Varianten und auch an induzierbaren Linien in Arabidopsis weiter charakterisiert werden. Auch ist geplant, die Transporter von P. vulgaris in transgenen Adventivwurzeln (hairy roots) und Wurzelknöllchen, in denen die entsprechenden Gene durch CRISPR/Cas9 mutiert wurden, auf ihre Funktion zu untersuchen - inklusive ihrer Rolle in der Ureidsynthese. In Promoter-Reporter und Promoter-Gen-Reporter Studien mit fluoreszierenden Reportern in transgenen Knöllchen sollen die gewebespezifischen Promotoraktivitäten und die subzellulären Lokalisationen der neuen Transporter sowie der bekannten Ureid-Biosyntheseenzyme untersucht werden, um ein neues Modell des Stoffwechselwegs der Ureidsynthese im Knöllchen von P. vulgaris zu erstellen. Komplementationsstudien mit den pflanzlichen Transportern in Mutanten von Escherichia coli und Studien zur Substratspezifität und Transportkinetik nach Expression in E. coli sollen die funktionelle Beschreibung abrunden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen