Schaltbare anti-CRISPR Proteine als Plattform für dynamische und modulierbare CRISPR-Cas Genomperturbationen

• Antragsteller: Professor Dr. Dominik Niopek
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Strukturbiologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 453202693

Die CRISPR-Cas Technologien haben die Forschung in den Biowissenschaften revolutioniert und bergen ein enormes Potenzial für die Behandlung genetisch bedingter Erkrankungen. Um die Genauigkeit von CRISPR-Perturbationsstudien zu verbessern und eine sichere, klinische Translation der CRISPR-(Epi)Genomeditierung zu gewährleisten, sind Strategien, die ein raumzeitlich-präzises Anschalten, Abschalten oder auch eine Feinregulation von Cas-Effektoren ermöglichen, essentiell. Anti-CRISPR-Proteine (Acrs) sind in Bakteriophagen vorkommende, potente CRISPR-Inhibitoren, die eine neue, bislang weitgehend unerforschte regulatorische Ebene von CRISPR-Systemen darstellen. In ihrer natürlichen Form sind Acrs konstitutive Inhibitoren, die die Cas-Aktivität unterdrücken, sobald sie in einer Zelle vorhanden sind. In diesem Projekt schlagen wir die Entwicklung einer innovativen Plattform zur CRISPR-Regulation vor, die auf schaltbaren Acrs basiert, d.h. auf künstlichen Inhibitoren, die die Cas Aktivität an exogene Stimuli koppeln. Durch eine Kombination aus bioinformatischen und experimentellen Ansätzen werden wir zunächst allosterische Regionen auf der Proteinoberfläche ausgewählter Acrs identifizieren, nämlich AcrIIA4, AcrIIA5, AcrIIC3, AcrVA1 und AcrVIA5. Zusammen genommen inhibieren diese Acrs alle aktuell gängigen Cas9, Cas12 und Cas13a Orthologe. Im nächsten Schritt werden wir dann Hybride aus diesen Acrs und verschiedenen sensorischen Domänen erzeugen, wodurch wir die Cas-Inhibition unter Kontrolle verschiedener Stimuli stellen, entweder Licht (blaues Licht, infrarotes Licht) oder klinisch zugelassene Pharmazeutika (Rapamycin oder 4-Hydroxytamoxifen). Die resultierenden, schaltbaren Acrs werden eine raumzeitlich exakte Genom- bzw. Transkriptomeditierung mit Hilfe von Cas9, Cas12 oder Cas13a ermöglichen. Sie können aber ebenfalls zur Echtzeitsteuerung von flexibel-konfigurierbaren Effektoren basierend auf katalytisch-inaktiven Cas Varianten eingesetzt werden. Um das große Potential unserer einzigartigen CRISPR-Regulationsplattform zu demonstrieren, werden wir die schaltbaren Acrs dazu verwenden, logische Schalter zu implementieren, die die Cas Aktivität unter Kontrolle bestimmter Stimuluskombinationen stellen. Abschließend werden wir die konstruierten, lichtinduzierbaren Acrs mit epigenetischen CRISPR-Effektoren kombinieren. Auf diese Weise können wir dann die Dynamik der Genexpression nach induzierter Veränderung des Epigenoms untersuchen, was beispielsweise im Kontext der Zelldifferenzierung oder Kanzerogenese von großer Relevanz ist. Zusammengenommen werden unsere schaltbaren Anti-CRISPR-Proteine die Interrogation der eukaryotischen Gen- und Genomregulation ermöglichen, aber auch neue Anwendungsmöglichkeiten von CRISPR in der Industrie und Medizin schaffen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen