Nutzung von Nukleinsäure-Strangverdrängungsreaktionen für Sensorik und Informationsverarbeitung in lebenden Zellen

• Antragsteller: Professor Dr. Friedrich Simmel
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Biologische und Biomimetische Chemie ; Biophysik
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 453249455

Das übergeordnete Ziel des Projektes ist die Verwendung sogenannter „Strangverdrängungsprozesse“ (das ist der dynamische Austausch von RNA-Strängen in einer RNA-Struktur), um einfache Informationsverarbeitungsprozesse in lebenden Zellen und insbesondere in Säugetierzellen durchführen zu können. Dies erlaubt das Auslesen des zellulären Zustands über das Vorhandensein bestimmter RNA-Moleküle und ermöglicht es, auf diesen durch Ändern der Transkriptionsniveaus oder sogar durch Modifizieren des Genoms der Zelle zu reagieren. Unser Projekt baut auf unseren früheren Arbeiten zu strangverdrängenden guide RNAs (SD-gRNAs) für die CRISPR-assoziierte Nuklease Cas12a auf, deren Funktion bereits in vitro und in Bakterienzellen gezeigt werden konnte. Der Aufbau leistungsfähigerer RNA-Schaltkreise in der komplexen Umgebung lebender Zellen ist mit erheblichen Herausforderungen verbunden, auf die wir in diesem Projekt eingehen möchten.In einem ersten Schritt sollen Designregeln für effiziente Strangverdrängungskreise in Säugetierzellen definiert werden. Um solche Prozesse in Säugetierzellen effizient ausführen zu können, werden wir verschiedene RNA-Designparameter untersuchen, von denen wir einen Einfluss auf Hybridisierungs- und Strangverdrängungskinetik erwarten. Ferner zielen wir auf die Entwicklung eines Satzes orthogonaler Komponenten ab, die Schaltungen mit mehreren „Inputs“ ermöglichen. Schließlich werden wir unsere Designregeln verwenden, um komplexere Schaltungskaskaden zu erzeugen.Wir wollen auch zusätzliche Einflüsse auf die Kinetik von Strangverdrängungsprozessen verstehen, die in der komplexen Umgebung einer Zelle eine Rolle spielen könnten. Zu diesem Zweck werden wir verschiedene Aspekte der zellulären Umgebung experimentell im zellfreien Kontext modellieren. Insbesondere werden wir den Einfluss eines großen Pools an konkurrierenden DNA- oder RNA-Sequenzen auf die Kinetik der Strangverdrängung untersuchen, aber auch andere Aspekte wie das makromolekulare Crowding. Auf der Basis der daraus gewonnenen Erkenntnisse werden wir existierende Modellierungsansätze für Nukleinsäure-Reaktionsnetzwerke erweitern, um im Idealfall die Kinetik von Strangverdrängungsprozessen in vivo vorhersagen zu können.Schließlich werden wir unsere Erkenntnisse nutzen, um natürliche RNA-Moleküle als Input für Strangverdrängungsschaltkreise in Säugetierzellen zu verwenden. Um zelluläre RNA-Spezies zu nutzen, werden wir Strategien entwickeln, die eine effiziente Hybridisierung mit langen RNA-Molekülen mit ihren spezifischen Sequenz-Randbedingungen zu ermöglichen. Dazu gehören eine Analyse der für die Hybridisierung verfügbaren Sequenzdomänen sowie die Konkurrenz mit RNA-bindenden Proteinen. Nicht zuletzt werden wir auch den Einfluss der intrazellulären Lokalisation und die Konzentration der RNA-Moleküle auf die Funktionalität unserer Schaltkreise untersuchen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen