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Erstellung einer dynamischen raum-zeitlichen Karte der Genexpressionsregulierung während der Differenzierung von intestinalen Stammzellen zu Enterozyten

Antragstellerin Dr. Nike Walther
Fachliche Zuordnung Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung
Biophysik
Zellbiologie
Förderung Förderung von 2020 bis 2023
Projektkennung Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 453309976
 
Erstellungsjahr 2024

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Die zellulären Genexpressionsprogramme unterliegen während der Embryonalentwicklung und der Erneuerung adulter Gewebe starken Veränderungen. Beiden Vorgängen liegt die Differenzierung von Stammzellen zu spezialisierten Zelltypen, aus denen Gewebe und Organe aufgebaut sind, zu Grunde. Da eine abnormale Genexpression charakteristisch für Entwicklungsstörungen und Krebs ist, erfordert es präzise Kontrollmechanismen, um die Entstehung und den Erhalt gesunder Gewebe sicherzustellen. Eine solche regulatorische Ebene stellen das Zellschicksal bestimmende Transkriptionsfaktoren (TFs) dar, die durch Bindung an spezifische DNA-Motive die Expression von Zielgenen induzieren bzw. unterdrücken. Es bleibt jedoch nur unzureichend verstanden, wie die Zellidentität und der Übergang von Zellzuständen durch das Expressionslevel und die biophysikalischen Eigenschaften von TFs in Abhängigkeit von der Position einer Zelle in einem differenzierenden Gewebe moduliert werden. Diese Fragen adressierte ich in dem sich schnell erneuernden Darmepithel, in dem Stammzellen entlang der Krypt-Villus-Achse differenzieren. Hierzu stellte ich Dünndarmorganoide der Maus her, so genannte in der Petrischale wachsende Minidärme, die zentrale Eigenschaften des Darms widerspiegeln. Diese exprimierten mit einem Halo-Tag verknüpfte transgene TFs und ermöglichten eine dynamische Einzelmolekülmikroskopie der TFs im lebenden Organoid. Um den Durchsatz dieses Assays zu erhöhen, wirkte ich and der Entwicklung eines automatisierten Workflows zur Bildgebung und zielgerichteten Analyse mit. Dieser ermöglichte es mir TF-Einzelmolekültrajektorien hunderter Zellen in heterogenen in 2D wachsenden Einzelschicht-Organoidmodellen aufzunehmen, bestimmte Zelltypen anzuvisieren, Zellpositionen relativ zu Gewebemerkmalen zu erfassen, und TF- Diffusionsparameter mit dem relativen TF-Expressionslevel, dem Zelltyp und den morphologischen Eigenschaften der Zelle zu korrelieren. Bei der Untersuchung zweier das Schicksal der Nährstoff-absorbierenden Zelllinie bestimmenden TFs fand ich gegensätzliche Diffusionsverhalten unabhängig vom TF-Expressionslevel: Während der das Schicksal dieser Zelllinie bestimmende TF Hes1 durch eine starke Zellvariabilität und eine Fraktion immobiler DNA-gebundener Moleküle von ~32% gekennzeichnet wird, wird der die Identität von Enterozyten bestimmende TF Hnf4g von homogeneren Dynamiken und einer gebundenen Molekülfraktion von ~56% charakterisiert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das TF- Diffusionsverhalten den Differenzierungsfortschritt anzeigen und frühe bzw. späte Differenzierungsschritte zu Enterozyten modulieren könnte. Zusammenfassend kann der hier entwickelte, vielseitig anwendbare Workflow zur automatisierten Einzelmolekülmikroskopie in lebenden Zellen Größenordnungen vom Gewebe zur Einzelmolekülebene überbrücken, wodurch Studien zu den molekularen Mechanismen, die der Differenzierung und Entstehung von Gewebephänotypen unterliegen, ermöglicht werden. Darauf basierend werden weitere Forschungen eine universelle Anwendbarkeit des hier gefundenen Prinzips, nämlich, dass das dynamische Verhalten von TFs den Übergang von Zellzuständen unterstützt, im Kontext der Darmdifferenzierung und darüber hinaus adressieren, wie zum Beispiel der Homöostase und Regenerierung von Geweben, der malignen Zellentwicklung und Entstehung von Krebs sowie der Embryonalentwicklung.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

 
 

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