Aufklärung der Bedeutung von Flavodoxinen im intestinalen Pathogenen Clostridioides difficile
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Flavodoxine sind kleine, elektronenübertragende Proteine mit niedrigem Redoxpotential und der Fähigkeit, Ein-Elektronen-Übertragungsreaktionen zu katalysieren. Abgesehen von wenigen Ausnahmen sind Flavodoxine als unabhängige Proteine ausschließlich in Prokaryoten zu finden. In einigen Organismen konnte gezeigt werden, dass sie an essentiellen metabolischen Prozessen beteiligt sind, unter Eisenlimitation Ferredoxine ersetzen oder die oxidative Stressresistenz erhöhen können. Für das intestinale humane Pathogen Clostridioides difficile ist eine weit überdurchschnittliche Anzahl von 8 putativen Flavodoxinen vorhergesagt. Für das Flavodoxin FldX wurde gezeigt, dass Eisenlimitation induzierend wirkt, ansonsten ist die Funktion der Flavodoxine in C. difficile bisher nicht geklärt. Eingehende in-silico Analysen zeigten die typische αβα-Sandwich Struktur der 8 Flavodoxine auf. Für eines der Flavodoxine wurden jedoch zusätzliche Eisen-Schwefel-Cluster vorhergesagt, sodass es kein „echtes“ Flavodoxin darstellt. Interessanterweise spiegeln die Strukturen der übrigen Flavodoxine nicht in jedem Fall die bisher für Gram-positive Bakterien angenommene kurzkettige Form wider, sondern weisen zusätzliche Helices oder Schlaufen auf, wie bisher nur von Gram-negativen Bakterien und Algen bekannt ist. Die über bisher bekannte Stämme der Spezies C. difficile konservierten Flavodoxine weisen untereinander wenig Ähnlichkeit auf, besitzen jedoch Homologe in anderen strikten Anaerobiern. Transkriptionsstudien legten die Expression von 6 der 7 Flavodoxinen in wachsenden C. difficile Zellen offen. Für fldX konnte eine starke Induktion nicht nur während Eisenlimitation sondern auch nach Einwirkung von Sauerstoff gezeigt werden. Gezielte Massenspektrometrische (MS) Untersuchungen validierten die Induktion auf Proteinebene. Das Flavodoxin CD2825 wird durch Wasserstoffperoxid induziert. Mit Hilfe eines polyklonalen Antikörpers gegen FldX konnte das Flavodoxin via Immunogold-Labellings an der Zellmembran lokalisiert werden, was auf eine Interaktion mit Membranproteinen schließen lässt. Der Antikörper wurde desweiteren genutzt, um FldX und interagierende Proteine aus Proteinextrakten unterschiedlicher physiologischer Bedingungen zu präzipitieren. Die putativen Interaktionspartner wurden mittels MS identifiziert und relativ quantifiziert. Die Daten werden derzeit ausgewertet und werden Hinweise auf die zelluläre Funktion von FldX geben. Eine Deletion von fldX war uns nicht möglich, was auf seine Essentialität hindeutet. Deletionsmutanten der Gene für die Flavodoxine wrbA, CD2825, CD2207 und CD2684 konnten generiert werden und können nun mittels vergleichender Proteomics-Studien charakterisiert werden, um auf mögliche zelluläre Funktionen zu schließen. Zusammenfassend konnte für 6 Flavodoxine in C. difficile eine aktive Expression nachgewiesen werden, wobei 2 von ihnen unter infektions-relevanten Bedingungen induziert werden. Damit stellen Flavodoxine in C. difficile potentielle Zielstrukturen für neue, antimikrobielle Therapieansätze dar.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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at the 12th International Conference on the Molecular Biology and Pathogenesis of the Clostridia (Clostpath), 13 – 16/09 2021, digital, Tracking the expression of eight different flavodoxins of Clostridioides difficile under iron limitation and oxidative stress
Daniel Troitzsch, Silvia Dittmann, Fabian Marek, Timon Alexander Möller, Linda Trän & Susanne Sievers
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at the annual conference of the VAAM, 17 – 20/03 2022, (digital) Tracking the expression of eight different flavodoxins of Clostridioides difficile under iron limitation and oxidative stress
Robert Knop, Daniel Troitzsch, Silvia Dittmann, Fabian Marek, Timon Alexander Möller, Linda Trän & Susanne Sievers
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Invited talk at MICALIS Institute INRAE, 13/05 2022, Jouy-en-Josas, France; Pinpointing hubs of adaptation in the human pathogen Clostridioides difficile as potential new therapeutic targets
Sievers, S.
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Invited talk at the Proteomics Spring School, 21/03 2022, Greifswald, Germany; A proteomics approach to understand the patho-physiology of Clostridioides difficile
Sievers, S.
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Invited talk Réseau CD France, Université de Paris, 12/05 2022, Paris, France; Pinpointing hubs of adaptation in the human pathogen Clostridioides difficile as potential new therapeutic targets
Sievers, S.
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poster at 2nd Summer School “Infection Biology”, 26 – 28/09 2022, Greifswald, Germany; Tracking the expression of eight different flavodoxins of Clostridioides difficile under iron limitation and oxidative stress
Robert Knop, Daniel Troitzsch, Silvia Dittmann, Timon Alexander Möller, Linda Trän & Susanne Sievers
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Lecture at the „Kinder- und JugendUni 2023“ at the University of Greifswald Multikulti im Darm: Warum wir Mikroorganismen zum Gesundbleiben brauchen
Sievers, S.
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Poster at the 13th International Conference on the Molecular Biology and Pathogenesis of the Clostridia (Clostpath), 19- 23/09 2023, Banff, Canada, The putative flavodoxin FldX and its role in the oxidative stress response in Clostridioides difficile
Robert Knop, Daniel Troitzsch, Silvia Dittmann, Thaddäus Echelmeyer, Johanna Pukall, Lisa Hill, Valeria Kamozina & Susanne Sievers
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Characterizing the flavodoxin landscape in Clostridioides difficile. Microbiology Spectrum, 12(3).
Troitzsch, Daniel; Knop, Robert; Dittmann, Silvia; Bartel, Jürgen; Zühlke, Daniela; Möller, Timon Alexander; Trän, Linda; Echelmeyer, Thaddäus & Sievers, Susanne
