Funktionen der Histon-Chaperone FACT und Bromodomän-AAA + -ATPasen in der Heterochromatin-Ausbreitung und der Centromerbiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das eukaryotische Genom besteht aus transkriptionell aktivem Euchromatin und Heterochromatin, das transkriptionell stumm ist und eine entscheidende Rolle bei der Genomstabilität, der Chromosomensegregation und der Aufrechterhaltung der Zellidentität spielt. Die Bildung von Heterochromatin ist ein schrittweiser Prozess, der Folgendes umfasst: Nukleation, Ausbreitung entlang der Chromosomenarme und stabile Aufrechterhaltung nach der DNA-Replikation. Die Unterbrechung eines dieser Schritte führt zu Heterochromatindefekten und Genfehlexpression. Das Histon-Chaperon FACT (Facilitates Chromatin Transcription) wurde mit der Heterochromatin-Stilllegung in Verbindung gebracht, aber seine genaue Rolle blieb unklar. Im ersten Projekt identifizierten wir die spezifische Funktion von FACT bei der Heterochromatin-Ausbreitung in Schizosaccharomyces pombe. In diesem Modellorganismus beginnt die Heterochromatin-Assemblierung an Nukleationsstellen, wo verschiedene Mechanismen die einzige H3K9-Methyltransferase, Clr4, rekrutieren. Nach der Rekrutierung leitet Clr4 die Ausbreitung durch einen „Schreib-“ und „Lese“-Mechanismus ein. Als „Schreiber“ fügt Clr4 nicht nur die H3K9-Methylierungsmarkierung hinzu, sondern erkennt sie auch über seine Chromodomäne. Darüber hinaus erfordert die Ausbreitung die Beteiligung des „Lesers“, des Heterochromatinproteins 1 (Swi6 in S. pombe), das über seine Chromodomäne an die H3K9me2/3-Markierungen bindet. Mithilfe von Genomik, Hefegenetik und Einzelzell-Fluoreszenzreporter-Tests haben wir gezeigt, dass FACT die Nukleation nicht reguliert, sondern die Ausbreitung des Heterochromatins entlang der Chromosomenarme erleichtert. FACT-Mutanten zeigten eine verringerte Ansammlung von H3K9me2, H3K9me3 und Swi6 an Subtelomeren und eine Derepression von Genen in der Nähe der Heterochromatingrenzen. Ein Heterochromatin-Ausbreitungstest zeigte außerdem eine beeinträchtigte Ausbreitung am Paarungstyp-Locus bei den Chaperon-Mutanten. Die Rekrutierung von Clr4 zu Nukleationsstellen blieb unberührt. Wir haben gezeigt, dass der Ausbreitungsdefekt bei FACT-Mutanten auf einen beeinträchtigten Übergang von H3K9me2 zu H3K9me3 zurückzuführen ist, einem Schlüsselschritt im Ausbreitungsprozess. Die H3K9me3-Methylierung durch Clr4 ist langsamer als die Mono- und Dimethylierung und erfordert eine längere Verweilzeit auf dem Nukleosom. Durch die Reduzierung des heterochromatischen Nukleosomumsatzes erleichtert FACT die H3K9-Trimethylierung und eine effiziente Heterochromatinausbreitung. Zusammengenommen liefern unsere Erkenntnisse entscheidende Einblicke in den Ausbreitungsmechanismus von Heterochromatin und unterstreichen die Rolle des konservierten Histon-Chaperons in diesem Prozess. Im zweiten, unveröffentlichten Projekt untersuchten wir die neuartige Bromodomänen- AAA+-ATPase Abo2 in Bezug auf die Centromerenfunktionen in S. pombe. Wir fanden heraus, dass Abo2, nicht jedoch sein Paralog Abo1, spezifisch auf Centromerenchromatin lokalisiert ist. Der Abo2-Mutant abo2∆ zeigt mitotische Phänotypen, darunter TBZ-Empfindlichkeit, verzögerte Chromosomen und ungleiche Chromosomensegregation, was Abo2 mit Chromosomensegregationsfunktionen in Verbindung bringt. Obwohl die Zusammensetzung der Centromeren-Histonvariante CENP-A (Cnp1 in S. pombe) im Stamm abo2∆ nicht beeinträchtigt war, war der Cnp1-Spiegel an den Grenzen zwischen Centromeren und pericentromerem Heterochromatin reduziert, was darauf hindeutet, dass Abo2 als Grenzfaktor am Centromeren fungieren könnte. Darüber hinaus akkumuliert sich FACT am Centromeren in Abwesenheit von Abo2, was darauf hindeutet, dass Abo2 die Chaperondynamik am Centromerenchromatin reguliert. Der Abo2-Mutant zeigt synthetische genetische Interaktionen mit mehreren Centromerenkomponenten. Zukünftige Studien werden darauf abzielen, den Mechanismus von Abo2 bei der Chromosomensegregation in S. pombe und seine Konservierung in Säugetierzellen zu untersuchen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
-
The histone chaperone FACT facilitates heterochromatin spreading by regulating histone turnover and H3K9 methylation states. Cell Reports, 37(5), 109944.
Murawska, Magdalena; Greenstein, R.A.; Schauer, Tamas; Olsen, Karl C.F.; Ng, Henry; Ladurner, Andreas G.; Al-Sady, Bassem & Braun, Sigurd
-
Chaperoning heterochromatin: new roles of FACT in chromatin silencing. Trends in Genetics, 38(7), 646-649.
Murawska, Magdalena & Braun, Sigurd
-
Pioneers conquer core histones at the chromatin frontier. Nature Structural & Molecular Biology, 30(8), 1050-1053.
Murawska, Magdalena; Ladurner, Andreas G. & Margulies, Carla E.
