Entwicklung von PKS-Biokatalysatoren am Beispiel einer Multienzymkaskade zur verbesserten Synthese antifungaler Polyketide
Organische Molekülchemie - Synthese, Charakterisierung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Polyketidsynthasen (PKS) sind Enzyme des Sekundärstoffwechsels mit großem Potenzial für die Biotechnologie. Ziel dieses Projektes war es, die Etablierung von PKS-Modulen als in vitro Biokatalysatoren voranzutreiben. Exemplarisch sollte eine Multienzymkaskade mit dem Modul AmbMod4 aus der Ambruticin-PKS im Zentrum entwickelt und für die formale chemoenzymatische Synthese von Jerangolid A eingesetzt werden. Die Herstellung von AmbMod4 sollte optimiert und eine geeignete Thioesterase (TE)-Domäne zur selektiven Ablösung des Modulproduktes identifiziert werden. Diese Kaskade sollte schrittweise um eine C-Methyltransferase (CMT) und eine Zyklase (Zyk) erweitert werden. Eine Reihe von TE-Domänen wurde in Hydrolyse-Vorversuchen getestet. Da diese nicht die gewünschte Substratselektivität zeigten wurden C-terminale TE-Fusionen an AmbMod4 vorgenommen, um einen kompakten Biokatalysator mit höherer Hydrolysewahrscheinlichkeit des Produktes zu erhalten. Durch heterologe Genexpression hergestelltes AmbMod4 prozessierte das Surrogat des authentischen Vorläufers, SNAC-2-D-5a, nur in sehr geringem Maße zum Zielprodukt 9a. Ein Engineering des Moduls durch Fusion unterschiedlicher TE-Domänen und N-terminaler Docking-Domänen verbesserte dieses Ergebnis nicht. Umfangreiche Aufklärungsexperimente zeigten, dass weder ein zusätzlicher Kontakt von AmbMod4 zu den Nachbarmodulen AmbMod3 und AmbMod5 oder zu der CMT AmbM zu einer relevanten Verbesserung des Umsatzes zu 9a führten. Bei schrittweiser Rekonstitution der Modulkatalyse zeigte die trifunktionale Domäne AmbDH4 im in vitro System ihre volle Dehydratase (DH)- und Enoylisomerase (EI)-Aktivität, allerdings nur sehr eingeschränkte Epimerase (Epi)-Aktivität und wurde dadurch als Flaschenhals identifiziert. Daher wurde die bereits im Antrag formulierte Alternativstrategie verfolgt, die Kaskade auf der Basis von Modul-Fragmenten zu etablieren. Neue Kaskaden aus Alkoholdehydrogenasen und der Heterozyklase AmbDH3 ermöglichten einfachen Zugang zu chiralen Tetrahydropyranylthioestern, welche dann als Vorläufer für die Umsetzung durch die AmbKS4-AT4 Didomäne und die AmbKR4-DH4-ACP4 Tridomäne zum verlängerten -Hydtroxythioester dienten. Kombinationen von AmbDH4 und der C-Methyltransferase AmbM überführten das SNAC 4-D-2-Enthioate 8a in das gewünschte Modulprodukt. Gegen Ende der Projektlaufzeit konnte bei Verwendung der Thioesterasen MonCII und FosTEII durch gezielte Mutation der KS4 und DH4-Domänen der Modulumsatz auf 23% gesteigert werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Towards understanding oxygen heterocycle-forming biocatalysts: a selectivity study of the pyran synthase PedPS7. Organic & Biomolecular Chemistry, 20(48), 9645-9649.
Wagner, Lisa; Stang, Jörg; Derra, Sebastian; Hollmann, Tim & Hahn, Frank
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Highly Stereoselective Biocatalytic One-Pot Synthesis of Chiral Saturated Oxygen Heterocycles by Integration of a Biosynthetic Heterocyclase into Multiple-Enzyme Cascades. ACS Catalysis, 14(17), 13420-13428.
Roß-Taschner, Theresa; Derra, Sebastian; Stang, Jörg; Schlotte, Luca; Putratama, Anthony & Hahn, Frank
