Massen-Photometrie entschlüsselt den Mechanismus des menschlichen Proteasoms

• Antragsteller: Dr. Emanuel Pfitzner
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 455633413

Das Proteasom ist eine lebenswichtige molekulare Maschine, die in jeder eukaryotischen Zelle Polypeptide zerkleinert. Es recycelt Proteine und verhindert die toxische Anhäufung von Peptidaggregaten. Dafür erkennt es Proteine, die mit Ubiquitin markiert sind und baut sie in seinem katalytischen Lumen ab. Das Proteasom ist zentraler Bestandteil vieler zellulärer Regelmechanismen, indem es die relativen Konzentrationen von Proteinen einstellt. Das macht das Proteasom zu einem idealen Ziel für Medikamente, die Zellen angreifen, die an fehlreguliertem Proteinabbau – z.B. durch neurodegenerative oder Krebserkrankungen hervorgerufen – leiden.Um Medikamente gezielt entwickeln zu können, ist es essenziell, sowohl die Wechselwirkungen von Ubiquitin und dem Proteasom als auch dessen katalytische Funktion zu verstehen. Obwohl das menschliche 26S Proteasom schon Jahrzehnte untersucht wird, sind kaum kinetische Informationen verfügbar und müssen aus einer immensen Anzahl verschiedener Experimente zusammengestellt werden. Noch immer fehlt es an einem umfassenden Verständnis der Erkennung, Bindung und gezielter Degradierung von Substraten, da hauptsächlich Ensembleexperimente möglich sind. Diese erlauben es nicht, den komplexen katalytischen Zyklus des 26S Proteasoms zu verfolgen.In dem beschriebenen Projekt werde ich eine neuartige Technik verwenden, die das gestreute Licht einzelner Proteine ohne künstliche Markierungen detektiert: interferometrische streuungsbasierte Mikroskopie (iSCAT). Zusammen mit einer geeigneten Kalibrierung kann damit die Masse einzelner Proteine mit einer Präzision von bis zu 10 kDa innerhalb weniger Sekunden gemessen werden – genannt Massen-Photometrie (MP).Mit Hilfe von MP ist es möglich die Wechselwirkung zwischen Substraten und dem Proteasom zu untersuchen. Ich werde die Bindung von Substraten an das Proteasom und die nachfolgenden Prozesse von Deubiquitylierung und Proteolyse auf Basis von Einzelmolekül-Experimenten in Abhängigkeit der Qualität des Ubiquitin-Tags quantifizieren. Dazu werden die Massenverteilungen von ubiquitylierten Substraten und dem Proteasom im Gleichgewicht mittels MP gemessen. Daraus können mittlere Affinitäten und Deubiquitylierungs-/Proteolyse-Raten bestimmt werden. Daraufhin werde ich den zeitlichen Verlauf der Massenverteilungen der Proteinkomplexe in Lösung bestimmen, nachdem Substrate und Proteasom schnell gemischt wurden. Zuletzt wird das Proteasom auf einer Oberfläche immobilisiert und Substrate in Lösung angeboten. Dies wird es ermöglichen, den kompletten katalytischen Zyklus in Echtzeit auf molekularer Ebene innerhalb eines konsistenten experimentellen Designs zu verfolgen.Die beschriebenen Experimente werden einen unmittelbaren Einfluss auf unser Verständnis des Proteasoms haben: eine detaillierte mechanistische und kinetische Beschreibung des katalytischen Zyklus. Diese Ergebnisse werden neue Konzepte für das Design von Medikamenten in der neurodegenarativen und Krebsforschung anregen.

• DFG-Verfahren: WBP Stipendium
• Internationaler Bezug: Großbritannien
• Gastgeber: Professor Dr. Philipp Kukura
• Beteiligte Person: Professor Dr. David Haselbach