Massen-Photometrie entschlüsselt den Mechanismus des menschlichen Proteasoms
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist ein lebenswichtiges Proteinsystem in eukaryontischen Zellen, das überschüssige und defekte Proteine aus dem Zelllumen entfernt. Proteine, die mit einer poly-Ubiquitin-Sequenz markiert sind, werden vom Proteasom erkannt und gezielt zerstört. Eine Fehlfunktion des UPS wird typischerweise mit verschiedenen (neurodegenerativen) Krankheiten in Verbindung gebracht. Trotz jüngster Fortschritte im Verständnis des katalytischen Prozesses basierend auf Einzelmolekülexperimenten fehlt ein detailliertes Bild der Substratbindung und Proteolyse. Massenphotometrie (MP) ist eine ideale Methode, die beteiligten Prozesse auf Einzelmolekülebene zu untersuchen. MP basiert auf der interferometrischen Detektion von Licht, das von einzelnen Proteinkomplexen gestreut wird woraus sich auf die molekulare Masse der Proteine rückschließen lässt. Wir haben zuerst aufgereinigtes menschliches 26s-Proteasom mit Hilfe von MP vermessen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass weitere Verbesserungen der Proteinpräparation und des experimentellen Aufbaus notwendig waren. Wir haben eine neuartige Kombination aus MP und Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikrokopie entwickelt. Die zeitgleiche Analyse der Fluoreszenzintensität und MP Antwort einzelner Proteine ermöglichte eine erhebliche Verbesserung der Massenauflösung im Vergleich zu etablierten Methoden. Durch die gleichzeitige Fluoreszenzdetektion konnte Lokalisierungspräzision erhöht werden, wodurch wir die Empfindlichkeit von MP im Vergleich zu herkömmlichen MP-Verfahren erhöhen konnten. Darüber hinaus haben wir einen holografischen Ansatz für MP entwickelt, der auf der Beleuchtung unter Totalreflektion basiert. Wir haben zum ersten Mal optische holografische Daten von einzelnen Proteinmolekülen gemessen. Die holografischen Daten enthalten im Gegensatz zu Standard-MP-Daten Phaseninformationen, die es ermöglichen, den Abstand der Moleküle zum Deckglas zu bestimmen. Schließlich haben wir einen neuen Ansatz zur effizienten Messung von Transmembranproteinen (TMP) entwickelt im Massenphotometer vorgestellt. Die Qualität der MP Daten von TMPs, die in Peptidscheiben rekonstituiert wurden, war denen, die von bisher verwendeten Solubilisierungsmethoden wie Nanodiscs oder Detergenzmizellen, überlegen. Obwohl wir vom ursprünglichen Arbeitsplan abgewichen sind, haben wir wichtige Fortschritte bei der MP-Instrumentierung gemacht. Diese wird in Studien eine effizientere Untersuchung des UPS erlauben.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Combination of single-molecule fluorescence and mass photometry. Biophysical Journal, 121(3), 430a-431a.
Pfitzner, Emanuel; Cole, Daniel & Kukura, Philipp
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Roadmap on Label‐Free Super‐Resolution Imaging. Laser & Photonics Reviews, 17(12).
Astratov, Vasily N.; Sahel, Yair Ben; Eldar, Yonina C.; Huang, Luzhe; Ozcan, Aydogan; Zheludev, Nikolay; Zhao, Junxiang; Burns, Zachary; Liu, Zhaowei; Narimanov, Evgenii; Goswami, Neha; Popescu, Gabriel; Pfitzner, Emanuel; Kukura, Philipp; Hsiao, Yi‐Teng; Hsieh, Chia‐Lung; Abbey, Brian; Diaspro, Alberto; LeGratiet, Aymeric ... & Lecler, Sylvain
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Single-protein optical holography.
Thiele, Jan Christoph; Pfitzner, Emanuel & Kukura, Philipp
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Characterization of membrane protein interactions by peptidisc-mediated mass photometry. iScience, 27(2), 108785.
Young, John William; Pfitzner, Emanuel; van Wee, Raman; Kirschbaum, Carla; Kukura, Philipp & Robinson, Carol V.
