Selbst-spaltende Molecular Beacons für die amplifizierende Nukeinsäuredetektion
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Chemische Reaktionen, die von DNA/RNA-Templaten kontrolliert werden, ermöglichen die Entwicklung kodierter Wirkstoffbibliotheken und potentiell Anwendungen in der Nucleinsäurediagnostik und der Theranostik. Ziel des Vorhabens war es, ein chemisches Amplifikationssystem zu entwickeln, das im Gegensatz zu früheren Methoden nicht von Produktinhibierung betroffen ist. Hierzu entwickelten wir als erste ihrer Art Reaktionen, die auf der Spaltung von Oligonucleotiden beruhen. Die Arbeiten führten zu zwei Reaktionssystemen, die beide auf einer photoreduktiven Spaltung von N-Alkylpicolinium(NAP)-arylethern beruhen. In einer Ausprägung bilden diese spaltbaren Linker das Herzstück von selbst-spaltenden Molecular Beacons (scMBs). Ein scMB ist analog zu traditionellen Molecular Beacons als Haarnadel konzipiert, enthält zusätzlich zu Fluorophor und Löscher jedoch auch einen NAP-Linker im Schleifenbereich. Wir demonstrierten, dass Fluorophore aus der Coumarin-Klasse die photoreduktive Spaltung des NAP-Linkers induzieren können, sobald der scMB durch Bindung an das Target geöffnet wird. Die Fluoreszenz steigt. Die Spaltprodukte binden das Target mit niedrigerer Affinität als der scMB vor der Spaltung. Das Target wird frei und entfaltet katalytische Wirksamkeit. So können 5 pM Target (0.0001 Äq.) nach nur 100 min Reaktionszeit die Fluoreszenz des als Reporter und Photosensibilisator wirkenden Atto425-Farbstoffs um mehr als 50% verstärken, was die Signalamplifikation früherer Reaktionssysteme übertrifft. Um höhere Signalverstärkungen zu erzielen, muss der Bleichung begegnet werden. Hierfür werden in laufenden Arbeiten leichter spaltbare SL entwickelt und die räumliche Nähe zum Fluorophor optimiert. In einer zweiten Ausprägung einer Spaltungsreaktion verknüpfte der SL ein PNA-Oligomer mit einer Spermingruppe, durch die die Stabilität eines PNA-DNA-Duplex erhöht wird. Die photoinduzierte Spaltung führt auch hier zu Produkten, die eine niedrigere Affinität für das Templat=Target haben als das Konjugat. Die Spaltung wird in diesen Reaktionssystem durch die benachbarte Bindung eines PNA-Konjugats induziert, das einen [Ru]2+-Photokatalysator in direkter Nähe positioniert. Die Photoreaktion spaltet einen NAP- Coumarin-Ether, wodurch die Coumarin-Fluoreszent steigt. Mit Wechselzahlen im Bereich von 3–10 min⁻¹ und einem kcat/KM = 1,3·10⁶ M⁻¹s⁻¹ zeigt das Reaktionssystem eine katalytische Effizienz, die den meisten enzymatischen Umsetzungen entspricht und bisher berichtete Nukleinsäure-vermittelte Reaktionen übertrifft. Die in dem Vorhaben entwickelten Reaktionen sind erste Beispiele für eine neue Art von DNA- oder RNA-gesteuerter Chemie, bei der das Prinzip des Affinitätsverlusts-durch-Reaktion eine hohe katalytische Effizienz ermöglicht.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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A Self‐immolative Molecular Beacon for Amplified Nucleic Acid Detection**. Chemistry – A European Journal, 27(57), 14189-14194.
Roth, Magdalena & Seitz, Oliver
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DNA-Templated Reactions with High Catalytic Efficiency Achieved by a Loss-of-Affinity Principle. Journal of the American Chemical Society, 144(24), 10700-10704.
Gluhacevic von Krüchten, Dino; Roth, Magdalena & Seitz, Oliver
