Der Einfluss von Caspase-8 auf die Aktivität der Cyclin-dependent kinase 9 bei der Regulierung der RNA-Polymerase-II-vermittelten Transkription beim Ovarialkarzinom

• Antragsteller: Dr. Khayal Gasimli, seit 6/2023
• Fachliche Zuordnung: Gynäkologie und Geburtshilfe ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 456711327

Das Ovarialkarzinom ist eine der tödlichsten gynäkologischen Krebserkrankungen der Welt. Über 70% der Fälle werden in fortgeschrittenen Stadien diagnostiziert, was zu einer schlechten Prognose führt, und sind weitgehend unheilbar. Beim Ovarialkarzinom wird Caspase-8 (C8) oft schwach exprimiert, was mit einer signifikant schlechteren Prognose der Patientinnen einhergeht (OV-TCGA, 491 Patientinnen). Unsere vorläufigen Arbeiten zeigen, dass C8:1. ein negativer Regulator der Zellmigration und -invasion ist,2. mit CDK9 interagiert und3. die CDK9-Aktivität in Bezug auf die RNA-Polymerase II, die eine produktive transkriptionelle Elongation vermittelt, negativ reguliert4. C8-KO-Zellen reagieren weniger empfindlich auf den Transkriptionsinhibitor GemcitabinFolgende Untersuchungen sind geplant: 1. Analyse des Einflusses von C8 auf die CDK9-Aktivität. Der 5-Ethynyl-Uridin-Assay wird für den quantitativen Vergleich der globalen Transkription zwischen C8-WT- und KO-Zelllinien verwendet. Inaktives CDK9 wird im Zytoplasma durch den Hsp90/Cdc37-Komplex zurückgehalten und zur Aktivierung in den Zellkern transportiert. Mit Hilfe der Zellfraktionierung und des Heterokaryon-Fusions-Assays soll festgestellt werden, ob C8 das nukleäre Shuttling hemmt. Eine Interaktom-Analyse dient dazu, zusätzliche Komponenten dieses Komplexes zu identifizieren und ihre Auswirkungen auf das Shuttling zu bestimmen.2. Analyse der Transkription von Metastasierungs-Genen reguliert durch C8. Eine globale Transcriptome- und Proteome-Analyse von C8 WT- und KO-Zellen ist geplant, um Gene zu identifizieren, deren Expression sich im Vergleich von WT- und C8-KO-Zellen signifikant unterscheidet. Deren Expression wird durch QT-PCRs und Immunoblots verifiziert und mit Hilfe von IPA und DAVID Bioinformatik-Ressourcen einer Gene-Ontology-Analyse unterzogen. Gene, von denen bekannt ist, dass sie an der Regulierung der Metastasierung beteiligt sind, werden durch Knockdown (RNAi) / Überexpression im Migrations- und Invasionstests validiert.3. Analyse von Metastasierungs-Genen in primären Ovarialkarzinomzellen und Zelllinien. Die Funktion relevanter Gene wird in OP-Material aus unserer Klinik/Zelllinien in Abhängigkeit der C8-Expression studiert. Deren Auswirkungen auf Expression und Aktivität bekannter Biomarker der Metastasierung werden bestimmt.4. Analyse der CDK9-Hemmung in Kombination mit Chemotherapeutika in einer Sphäroid-/Organoidbank. Sphäroid-/Organoidbänke werden aus C8 WT-, KO- Zelllinien bzw. primärem Tumormaterial etabliert, um die Reaktion auf CDK9-Inhibitoren in Kombination mit Standard-Chemotherapeutika zu testen.5. Analyse der CDK9-Inhibition in Kombination mit Chemotherapeutika in einem orthotopen Mausmodell. Mit Hilfe von Luziferase-exprimierenden WT- und C8-KO-Zellen wird eine Biolumineszenz Analyse der Metastasierung nach orthotopen Injektion (Ovarien) durchgeführt. Diese Mausmodelle werden mit Kombinationen von Chemotherapeutika und dem CDK9-Inhibitor LDC000067 behandelt.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: China
• Kooperationspartner: Professor Shengtao Zhou, Ph.D.
• Ehemaliger Antragsteller: Dr. Ranadip Mandal, Ph.D., bis 6/2023