In-situ Kryo-Elektronentomographie aktiv feuernder neuronaler Synapsen

• Antragstellerin: Dr. Jana Kroll
• Fachliche Zuordnung: Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen
• Förderung: Förderung von 2021 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 458275811

Seit mehr als 60 Jahren wird intensiv erforscht, wie Neurone miteinander über Botenstoffe kommunizieren. Heute weiß man, dass die Freisetzung von Neurotransmittern mittels Fusion von Vesikeln mit der Zellmembran (Exozytose) erfolgt, und dass eine Reihe von Schlüsselproteinen, wie etwa Calcium-Sensoren und SNARE-Proteine, den Fusionsprozess einleiten und regulieren. Insbesondere elektronenmikroskopische Untersuchungen haben zu unserem derzeitigen Verständnis von Exozytose an neuronalen Synapsen beigetragen. Während erste Experimente die Morphologie der Synapse im allgemeinen, inklusive aktiver Zone, Vesikeln und endozytotischen Strukturen, beschrieben haben, dient die Elektronenmikroskopie (EM) heute zur Quantifizierung feinster Veränderungen beispielsweise in Mausmutanten. Mit der Etablierung von Kryo-Fixiermethoden für die EM, beispielsweise mittels Hochdruckgefrierens, ist es heute möglich, zelluläre Strukturen in einem nahezu natürlichen Zustand zu untersuchen. Die Kryo-EM macht es sogar möglich, diese eingefrorene Zellen oder Gewebe direkt, also ohne Nachbehandlung oder Fixierung, zu untersuchen, und damit die bestmögliche strukturelle Auflösung zu erzielen. In dem hier vorgestellten Projektantrag möchte ich noch einen Schritt weiter gehen: ich plane, Kryo-Elektronentomographie (eine Form der ultra-hochauflösenden 3D-EM) mit physiologischer Stimulation zu kombinieren und gleichzeitig die neuronalen Synapsen, die durch die Stimulation angeregt wurden und Exozytose betreiben, mittels fluoreszierender Calcium- und Glutamatsensoren zu markieren. Die Stimulation erfolgt elektrisch mit Hilfe eines Hochdruckgefrierers, der es mir erlaubt, Neurone weniger als 5 ms nach Stimulation zu frieren und damit in ihrem aktiven Zustand zu erhalten. Die gefrorenen Neurone werden anschließend an einem Kryo-Konfokal-Mikroskop untersucht, aktive Synapsen werden identifiziert und für die Tomographie verwendet. Dieser Workflow hat drei entscheidende Vorteile gegenüber allen bisher entwickelten Methoden: (1) Ich kann die bestmögliche strukturelle Auflösung mit bestmöglicher zeitlicher Auflösung kombinieren, (2) ich kann feinste zelluläre Strukturen naturnah und in-situ untersuchen, und (3) ich kann Synapsen, die nach Stimulation Exozytose betrieben haben, mit solchen vergleichen, die nicht aktiv waren. Demzufolge kann ich mit Hilfe meines Workflows beispielsweise gezielt nach morphologischen Merkmalen aktiver Synapsen suchen und so feststellen, wie die variable Aktivität von Synapsen, und damit auch synaptische Plastizität, reguliert werden. Darüber hinaus werde ich gedockte Vesikel bezüglich eventueller struktureller Unterschiede in Aktivität und Ruhe untersuchen. Somit kann ich anhand der Morphologie bestimmen, wie wahrscheinlich es ist, dass ein Vesikel fusionieren kann. Ich bin voller Zuversicht, dass der von mir entwickelte Workflow nicht nur mir sondern auch anderen Wissenschaftlern dienen wird, unser Wissen über den Fusionsprozess in Neuronen zu erweitern.

• DFG-Verfahren: WBP Stelle