Untersuchung der raumzeitlichen Bindungsdynamik von Coronaviren und der Infektionsmechanismen mit 100 Hz ROCS Mikroskopie und thermischer Fluktuationsanalyse
Virologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In diesem Projekt wurde untersucht, wie sich SARS-CoV-2 Viren-ähnliche Partikel lebenden Zellen durch Diffusion nähern, versuchen an diese anzubinden, um dann unter günstigen Bedingungen aufgenommen zu werden. Die Infektion mit Viren sowie Partikeln mit ähnlichen Eigenschaften besteht aus mehreren aufeinanderfolgenden Schritten, wobei Diffusionskontakt und Anbindung die ersten entscheidenden Prozesse sind, bevor das Partikel in die Zelle eintritt. Aufgrund der hohen Dynamik der nur 0.1 µm großen Partikel, war die Beobachtung und tiefergehende Untersuchung dieser ersten Wechselwirkungsschritte vor dem Zelleintritt mit herkömmlicher Messtechnik bisher nicht möglich. Das Ziel dieses Forschungsvorhabens war die Entschlüsselung der dynamischen, diskontinuierlichen Bindungsprozesse von Viren, welche durch thermische Fluktuationen in Position und Orientierung bestimmt sind. Dies ist uns teilweise gelungen, wenngleich auch die Statistik der Einzelprozesse noch nicht gut genug ist. Zunächst ist es uns gelungen, die Anbindungsprozesse, welche auf einer teilweise zunächst unspezifischen Wechselwirkung zur Zell-Glycocalix oder an Zell-Protrusionen beruhen, mit einer neuartigen markierungsfreien Superauflösungs-Mikroskopie Methode aufzuzeichnen. Die Bildgebung basiert auf rotierendem, kohärent gestreutem Licht eines blauen Lasers (ROCS), mit der wir Tausende Bilder bei 100 Hz Bildaufnahmerate ohne Verlust an Bildqualität aufzeichnen. Die von uns vor ca. 10 Jahren in einer vereinfachten Form entwickelte Technik erlaubt es durch kohärente Kontrastbildung auf der Kamera sowohl kleine, sich schnell bewegende Partikel, als auch dynamische Zellen mit schnellen Filopodien oder Mikrovilli zu beobachten. Durch automatisches Tracking und durch Analysieren von thermischen Positionsfluktuationen der Partikel, konnten wir die zeitlichen Veränderungen in der Bindungsstärke von ca. 10 Partikeln pro Zelle bestimmen. Durch diverse, teilweise neue Mess- und Analysemethoden konnten wir verschiedene Partikel in ihrem Zellanbindungsverhalten quantifizieren, darunter 100 nm Glas- oder Polystyrolbeads, Beads mit SARS-COV-2 Spike-Proteinen an ihrer Oberfläche sowie schwach streuende SARS-COV-2 Virushüllenpartikel ohne RNA und pseudotyped VSV-SARS-CoV-2 S-ΔG- mCherry. Als Targets verwendeten wir A549 Lungen-Epithelzellen, J774 Makrophagen und ACE-2 Rezeptorreiche Caco2- Darm-Epithelzellen. Nur vereinzelt konnten wir den mehrstufigen Anbindevorgang der Partikel durch ihre charakteristische Fluktuationsbewegung aufzeichnen, sowie den Aufnahmevorgang durch eine zeitliche Kontraständerung des Partikelbildes. Eine große Herausforderung war es, die winzigen Partikel zwischen die Glasoberfläche und die (basale) Zelloberfläche zu bringen, um deren Dynamik oder Aufnahme im TIR-Modus sowohl mit ROCS, als auch mit Fluoreszenz sichtbar zu machen. Zumindest auf der dorsalen Seite, welche für die Partikel leichter zugängig ist, konnten wir diese markierungsfrei und mit guter Qualität durch die Lamellenpodien der Zelle hindurchsehen. Das Anbindungsverhalten mit ACE-2 Rezeptorblockern mit Spikeprotein-beschichteten Partikeln konnte nicht durchgeführt werden. In Summe kann das Projekt jedoch als erfolgreich gewertet werden, da eine Vielzahl von technologischen Hindernissen überwunden, dabei neue Beleuchtungsmodi entwickelt und mitunter einmalige Bildsequenzen aufgenommen werden konnten, die erstmalig Einblicke in die Virenanbindungs-Dynamik geben. Dieses Wissen inklusive Mikroskopiemethoden können für eine Vielzahl von weiteren Forschungsprojekten verwendet werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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100 Hz ROCS microscopy correlated with fluorescence reveals cellular dynamics on different spatiotemporal scales. Nature Communications, 13(1).
Jünger, Felix; Ruh, Dominic; Strobel, Dominik; Michiels, Rebecca; Huber, Dominik; Brandel, Annette; Madl, Josef; Gavrilov, Alina; Mihlan, Michael; Daller, Caterina Cora; Rog-Zielinska, Eva A.; Römer, Winfried; Lämmermann, Tim & Rohrbach, Alexander
