In-Vitro-Rekonstitution der 3-Prozessierung von mRNA-Vorläufern in Säugern

• Antragsteller: Professor Dr. Elmar Wahle
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 458691864

Die 3’-Enden von eukaryotischen mRNAs entstehen in einer zweistufigen Prozessierungsreaktion, die von einem großen Proteinkomplex katalysiert wird: Vorläufer-RNAs, die über das 3‘-Ende der reifen RNA hinausgehen, werden von einer Endonuklease gespalten, dann wird das 5‘-Spaltprodukt, das die kodierenden Sequenzen enthält, polyadenyliert, während das 3‘-Spaltprodukt abgebaut wird. In vitro lassen sich die beiden Teilreaktionen voneinander trennen. Den zweiten Reaktionsschritt, die Polyadenylierung, hatten wir in der ersten Förderperiode rekonstituiert. Jetzt ist es uns gelungen, die Spaltungsreaktion aus rekombinanten Proteinen zu rekonstituieren: sechzehn Polypeptide sind involviert, darunter fünf heterooligomere Komplexe und zwei Einzelfaktoren. Wir haben auch vorläufige Erkenntnisse, dass die Spaltreaktion von einer Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (liquid-liquid phase separation; LLPS) abhängt: Die Reaktion erfordert relativ hohe Proteinkonzentrationen und den Zusatz von „Crowding“-Reagentien, die eine hohe Gesamtkonzentration von Makromolekülen herbeiführen. Unter diesen Bedingungen kondensieren die Prozessierungsfaktoren und die Substrat-RNA in einer separaten flüssigen Phase, in der die Spaltreaktion abläuft. Diese Behauptungen werden durch vorläufige mikroskopische Analysen gestützt und durch die Tatsache, dass wir den Spaltkomplex, einschließlich Substrat- und Produkt-RNA, durch eine kurze Zentrifugation bei niedrigen g-Zahlen sedimentieren können. In dem beantragten Projekt wollen wir die folgenden Ziele verfolgen: Erstens wollen wir gewisse Aspekte der Spaltreaktion analysieren, z. B. die Rolle eines wenig charakterisierten Faktors, Rbbp6, die Funktion von ATP in der Spaltreaktion und den Abbau des 3‘-Fragments durch die 5‘-Exonuklease XRN2. Zweitens wollen wir die vorläufige Evidenz für die Rolle der LLPS in der Spaltreaktion weiter untersuchen. Zum Beispiel möchten wir wissen, welche Pufferbedingungen (Crowding-Reagentien), welche Proteine und welche Proteindomänen die LLPS begünstigen, und ob die Spaltung immer an LLPS gebunden ist. Wir werden versuchen, eine Hypothese zu entwickeln, warum die Spaltung LLPS-abhängig ist. Wir werden untersuchen, ob die Spaltprodukte, vor oder nach der Polyadenylierung, aus den phasengetrennten Kondensaten entlassen werden, und ob auch die Polyadenylierung durch LLPS gefördert wird. Drittens werden wir Aspekte der Erkennung der Substrat-RNA analysieren. Wir werden uns dabei zunächst auf eine wahrscheinliche Rolle von Rbbp6 in der RNA-Bindung konzentrieren und weitere Polypeptide untersuchen, wenn die Zeit das zulässt. Viertens werden wir uns um strukturelle Einsichten in den Prozessierungskomplex bemühen. In Kooperationen werden wir mit Hilfe der Massenspektrometrie die intra- und intermolekulare chemische Vernetzung von Prozessierungsfaktoren im Kontext des Spaltkomplexes analysieren, und wir werden zu einer strukturellen Untersuchung des Komplexes durch Kryo-Elektronenmikroskopie beitragen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen