Affinitätsbasierte Antikörper-Spezifikation zur Charakterisierung der PKA-Isoformen bei hyperalgetischer Signalübertragung in Nerventermini in vitro und in vivo

• Antragsteller: Professor Dr. Friedrich-Wilhelm Herberg; Professor Dr. Tim Hucho
• Fachliche Zuordnung: Pharmakologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 459759629

Antikörper sind unzuverlässige Werkzeuge z.B. für die Proteinlokalisierung, da das Ausmaß der Hintergrundbindung und Kreuzreaktivität weitgehend unbekannt ist. Aktuelle Protokolle zur technischen Optimierung von Antikörperabplikationen sind anfällig für Artefakte. Unser Ziel ist es, ein allgemein anwendbares Berechnungswerkzeug zu entwickeln, um die Anzahl der Bindungsstellen sowie die Affinität auf der Grundlage einfacher Messungen zu identifizieren, die in jedem Labor z.B. mit Hilfe der Immunfluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden können. Die Bedeutung einer solchen Technik werden wir an zwei Anwendungsbeispielen belegen. Zunächst werden wir die Werkzeuge zur Auswahl der besten Nanobodies verwenden, die gegen Isoformen der Proteinkinase A gerichtet sind, um aktivitätsabhängige Konformationen ihrer jeweiligen regulatorischen Untereinheiten zu erkennen. Zweitens werden wir diese neuen Nanobodies verwenden, um zum ersten Mal die isoformspezifische PKA-Aktivität in Neuriten nozizeptiver Neuronen in kultivierten Neuronen in vitro sowie in den Nervenenden im intakten Gewebe der Hornhaut in vivo zu analysieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen