Affinitätsbasierte Antikörper-Spezifikation zur Charakterisierung der PKA-Isoformen bei hyperalgetischer Signalübertragung in Nerventermini in vitro und in vivo
Zellbiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Antikörper werden in den Biowissenschaften und in der medizinischen Therapie in großem Umfang eingesetzt. Antikörperbasierten Methoden zur Untersuchung von Proteinen in Zellen oder Geweben wie der Immunzytochemie oder Histochemie fehlt jedoch die Möglichkeit, die Spezifität der Antikörper zu bestimmen. Daher haben wir im Rahmen des Antrages einen Ansatz zur Charakterisierung und Quantifizierung der Bindungseigenschaften von Antikörpern in zellulären Systemen entwickelt. Basierend auf dem Pseudo-Erste-Ordnung-Modell von Lagergren haben wir ein Modell der Antikörperakkumulation entwickelt, welches wir als Julia-Tool zur Analyse von quantitativen Bilddaten von Antikörperverdünnungsreihen realisiert haben. Dieses Tool verbessert die Auswahl spezifischer Antikörper, optimiert die Wahl der Verdünnung, und erlaubt es Veränderungen der subzellulären Nano-Umgebung zu erkennen. In einem nächsten Schritt wollten wir dieses Werkzeug einsetzen, um spezifische Nanobodies gegen Isoformen der Proteinkinase A (PKA) auszuwählen und mögliche aktivitätsabhängige Konformationsänderungen des Holoenzyms zu erkennen. Dazu exprimierten und reinigten wir die 4 verschiedenen Isoformen der regulatorischen PKA-Untereinheit (RIα, RIβ, RIIα, RIIβ), immunisierten Alpakas und generierten eine Phagemid-Bibliothek, die für die jeweiligen Nanobodies kodiert. PKA-Isoform-spezifische Nanobodies wurden durch Phage-Display ausgewählt und mittels ELISA auf immobilisierten R-Untereinheiten getestet. Nach der Sequenzierung und Gruppierung der Treffer wählten wir 10 Nanobodies für die weitere Charakterisierung in Zellen mittels quantitativem High-Content-Imaging aus. Vier der Nanobodies zeigten eine selektive Bindung an PKA-RIβ in transfizierten HeLa-Zellen und erzeugten zudem neuronale Signale in primären sensorischen Neuronen. Keiner dieser RIβ-spezifischen Nanobodies zeigte Veränderungen der Signalintensität nach Aktivierung aller PKA Isoformen durch Stimulation mit cAMP, weshalb sie wahrscheinlich nicht zur Isoform-spezifischen Visulisierung der PKA-RIβ eingesetzt werden können. In vitro Experimente mit gereinigten PKA Untereinheiten belegen jedoch, dass die Nanobodies die Interaktion zwischen der RIβ- und der katalytischen (C)-Untereinheit beeinflussen. Die Vorinkubation von RIβ mit den jeweiligen Nanobody verringerte die Anzahl der RIβ-Untereinheiten, die erforderlich ist, um die Aktivität der C-Untereinheiten zu hemmen. Dies deutet darauf hin, dass alle vier RIβ-Nanokörper die Holoenzymbildung beeinträchtigen. In weiteren Studien möchten wir die Bindungsstellen der Nanobodies identifizieren und prüfen, ob sie die Aktivität von PKA-RIβ modulieren bzw. zur Lokalisierung von endogenem PKA-RIβ in primären Neuronen eingesetzt werden können.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Drugging the Undruggable: How Isoquinolines and PKA Initiated the Era of Designed Protein Kinase Inhibitor Therapeutics. Biochemistry, 60(46), 3470-3484.
Lorenz, Robin; Wu, Jian; Herberg, Friedrich W.; Taylor, Susan S. & Engh, Richard A.
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Edmond Fischer's kinase legacy: History of the protein kinase inhibitor and protein kinase A. IUBMB Life, 75(4), 311-323.
Taylor, Susan S.; Herberg, Friedrich W.; Veglia, Gianluigi & Wu, Jian
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Modelling the Effect of Antibody Depletion on Dose-Response Behavior for Common Immunostaining Protocols
Tschimmel, Dominik, Steffen Waldherr & Tim Hucho
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Protein-Environment-Sensitive Computational Epitope Accessibility Analysis from Antibody Dose-Response Data
Tschimmel, Dominik, Momina Saeed, Maria Milani, Steffen Waldherr & Tim Hucho
