Entwicklung eines CRISPR-Imaging-Toolsets zur Abbildung von DNA und RNA in strukturell konserviertem Chromatin, das für Superauflösungsmikroskopie und Elektronenmikroskopie geeignet ist, und seine Anwendung zur Untersuchung der Substruktur von Holo- und Monozentromeren.
Strukturbiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die zeitliche und räumliche Organisation von Chromosomen und Zellkernen ist für die Regulation von Funktionen wie Genexpression, DNA-Replikation und -Reparatur sowie die korrekte Segregation des genetischen Materials wichtig. Im Rahmen des von der DFG geförderten Projekts wurde das CRISPR-Imaging-Toolset um neu entwickelte fluoreszierende und nichtfluoreszierende Methoden zur Markierung definierter genomischer Sequenzen erweitert. Im Gegensatz zur Standard Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH) entfällt bei der CRISPR- Bildgebung die Notwendigkeit einer globalen DNA-Denaturierung, was eine bessere Erhaltung der Chromatinstruktur ermöglicht. Unter Verwendung eines ALFA-markierten dCas9- Proteins, wurde die Markierung von Zielsequenzen mit einem fluoreszenzmarkierten ALFA-Nanokörper verbessert. Die Verwendung des Cas9-ALFA-Tag-Systems in Kombination mit FluoroNanogold ist möglich. Der Nachweis von FluoroNanogold-basierten Signalen mit Hilfe der Elektronenmikroskopie war jedoch nicht möglich, da es nicht gelang CRISPR-getaggte Proben auf Elektronenmikroskopiergitter zu übertragen. Außerdem haben wir die Tyramid-Signalverstärkungsmethode (TSA) erfolgreich mit der CRISPR-FISH Methode verknüpft. Um die Bildgebungsmethode zu vereinfachen, haben wir die chromogene Signaldetektion mit alkalischer Phosphatase oder Peroxidase-Enzymen mit der CRISPR-Bildgebung (CRISPR- CID) kombiniert. Dieser Fortschritt ermöglicht die CRISPR-Signaldetektion mit Hilfe eines Standard-Lichtmikroskops. Darüber hinaus wurde das CRISPR-basierte Live-Imaging verbessert. Der Einsatz einer intronisierten dCas9-Variante erhöhte die Signalintensität und ermöglichte erstmals die Bildgebung von Zentromeren und rDNA in transient transformierte Nicotiana benthamiana Zellen. Der Nachweis von RNA und Einzelkopie-Sequenzen in Kombination mit CRISPR war bisher für Pflanzen nicht erfolgreich.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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CRISPR-FISH: A CRISPR/Cas9-Based In Situ Labeling Method. Methods in Molecular Biology, 315-335. Springer US.
Potlapalli, Bhanu Prakash; Ishii, Takayoshi; Nagaki, Kiyotaka; Somasundaram, Saravanakumar & Houben, Andreas
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Application of ALFA-tag and tyramide-based fluorescence signal amplification to expand the CRISPR-based DNA imaging toolkit v1. ZappyLab, Inc..
Prakash Potlapalli, Bhanu; Fuchs, Joerg; Rutten, Twan; Meister, Armin & Houben, Andreas
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Genomische Sequenzen sichtbar machen. Biologie in unserer Zeit 54:37 - 40
Houben A., Potlapalli B.P. & Khosravi S.
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The potential of ALFA-tag and tyramide-based fluorescence signal amplification to expand the CRISPR-based DNA imaging toolkit. Journal of Experimental Botany, 75(20), 6244-6257.
Potlapalli, Bhanu Prakash; Fuchs, Jörg; Rutten, Twan; Meister, Armin & Houben, Andreas
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CRISPR-CISH: an in situ chromogenic DNA repeat detection system for research and life science education. Chromosome Research, 33(1).
Potlapalli, Bhanu Prakash; Dassau, Fabian; Fuchs, Jörg; Sushmoy, Deboprio Roy & Houben, Andreas
