The Arf GTPase module in vesicle formation: coordination of coat recruitment and membrane bending with ArfGAP activity
Final Report Abstract
Arf-GTPasen regulieren Membrantransportvorgänge zwischen intrazellulären Kompartimenten. Im GTP-gebundenen Zustand assoziieren sie einerseits über ihre Switch-Regionen mit Hüllproteinen, andererseits über eine N-terminal gelegene, amphipathische Helix mit Membranen. Ausgehend von unserer Beobachtung, dass rekombinantes Arf1-GTP in Abwesenheit von Effektorproteinen die Deformation von Membranen in tubuläre Strukturen bewirken kann, hatten wir postuliert, dass diese Fähigkeit eine Grundvoraussetzung für die Arfabhängige Bildung von Transportvesikeln darstellt. Wir konnten zeigen, dass der amphipathische Charakter der N-terminalen Helix essentiell dafür ist, dass Arf1 in lebenden Zellen mit tubulären Strukturen assoziiert, die am Golgi-Apparat gebildet werden, und die mit Hüllproteinen (COPI und GGA1) besetzt sind. Mutationen innerhalb der N-terminalen Helix nehmen Einfluss auf die Zahl der Arf1-positiven Tubulen in vivo und auf die Fähigkeit zur Membrantubulierung in vitro. Obwohl die Mutationen keinen Einfluss auf die Bindung von Effektormolekülen nahmen, beeinträchtigten sie doch die Arf1-abhängige Bildung von COPI-Vesikeln. Wir schließen daraus, dass die Membranaktivität von Arf1 sowie weiterer Mitglieder der Arf/Arl-Familie, eine essentielle Rolle bei Arf/Arl-vermittelten Transportvorgängen spielt. Der GTPase-Zyklus von Arf-Proteinen wird zeitlich und räumlich durch die Aktivitäten von ArfGEFs und ArfGAPs kontrolliert. Wie die Kopplung der GAP-abhängigen Inaktivierung an die erfolgreiche Formierung eines Transportcarriers erfolgt, ist weitgehend unklar. Vor diesem Hintergrund untersuchten wir die Assoziation von GIT, einem Arf6GAP, mit dem Hüllprotein Stonin 2 / Stoned B, das die Clathrin-abhängige Endozytose des synaptischen Vesikelproteins Synaptotagmin 1 vermittelt. Der Komplex erwies sich als evolutionär hoch konserviert, so dass wir seine funktionelle Bedeutung im experimentellen System der Fruchtfliege analysierten. Dgit- Mutanten von Drosophila wiesen reduzierte Mengen an Stoned B und an Synaptotagmin 1 auf; Stoned B war darüber hinaus mislokalisiert. Entprechend zeigten dgit-Mutanten morphologische und funktionelle Defekte bezüglich der Endozytose von synaptischen Vesikeln. Diese Befunde weisen darauf hin, dass GIT, das mit der präsynaptischen Zytomatrix verankert ist, endozytotische Ereignisse in unmittelbarer Nachbarschaft der aktiven Zone beeinflusst.
Publications
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